【摘要】：研究目的：基于皮層腦電圖的描記與分析,探討Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式；在此基礎(chǔ)之上,探究合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式改變的作用及機(jī)制研究。研究方法：第一部分、Period3基因敲除型純合子小鼠的繁育與子代鼠的基因鑒定分別取遺傳背景為C57BL/6J的Period3基因敲除型雜合子(Per3+/-)小鼠及野生型純合子(Per3+/+)小鼠各2只(2雄2雌)進(jìn)行飼養(yǎng)。小鼠8周大時(shí),分別將相同基因型的雌雄小鼠各一只配對育種。小鼠在遮光,通風(fēng),可控溫度和濕度的設(shè)備中繁殖。自由飲食飲水,12：12-h明暗交替。第四代斷奶后,收集尾部進(jìn)行基因鑒定。將小鼠尾部組織小段(長約0.3～0.5 cm)進(jìn)行基因組DNA的提取、PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳鑒定。分別將鑒定出的第四代Period3基因敲除型純合子小鼠和野生型小鼠進(jìn)行育種配對,以繁殖實(shí)驗(yàn)用小鼠。第五代斷奶后,再收集尾部組織進(jìn)行PCR基因鑒定,以確保小鼠基因型的穩(wěn)定。第二部分、Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式及機(jī)制的初步研究一、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠結(jié)構(gòu)的研究分別取雄性Period3基因敲除型純合子小鼠作為基因敲除組(Per3--組),雄性野生型小鼠作為空白對照組(WT組),每組各8只。兩組小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境一周后,進(jìn)行小鼠皮層腦電電極和肌電電極的埋置。小鼠回復(fù)7天后描記小鼠EEG/EMG5天(120小時(shí))。描記結(jié)束后,使用SleepSign 2.0分析。以10秒為一個(gè)單元分析EEG和EMG信號判斷覺醒(wake).NREM睡眠和REM睡眠,并用Excel 2010繪制睡眠時(shí)相序列圖(hypnogram)。二、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠覺醒時(shí)相的研究分別取雄性Period3基因敲除型純合子小鼠作為基因敲除組(Per3-/-組),雄性野生型小鼠作為空白對照組(WT組),每組各8只。兩組小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境一周后,進(jìn)行小鼠皮層腦電電極和肌電電極的埋置。小鼠回復(fù)7天后描記小鼠EEG/EMG 5天(120小時(shí))。描記結(jié)束后,使用SleepSign 2、0分析。以10秒為一個(gè)單元分析EEG和EMG信號。分別計(jì)算各時(shí)期(覺醒、NREMS.REMS)的持續(xù)時(shí)間,分別計(jì)算每小時(shí)的覺醒及各個(gè)睡眠時(shí)相所占的百分比；分別計(jì)算5天的覺醒及睡眠各時(shí)相平均成一天內(nèi)的每小時(shí)各個(gè)時(shí)相的持續(xù)時(shí)間百分比；分別計(jì)算每12小時(shí)時(shí)段(白天-夜間)的覺醒及各睡眠時(shí)相；分別計(jì)算每小時(shí)、每12小時(shí)(白天-夜間)的總睡眠次數(shù),并將5天的每一小時(shí)的睡眠次數(shù)平均為24小時(shí)每小時(shí)的睡眠次數(shù),以及白天時(shí)段-夜間時(shí)段的睡眠總次數(shù)；使用S1eepSign 2.0分析NREM睡眠期EEG的6波能量,計(jì)算每一小時(shí)NREMS δ波的能量及同天24 h NREM睡眠平均的δ波能量(計(jì)算成100%的δ波活動(dòng)),將二者相比,計(jì)算出每小時(shí)6波活動(dòng)的所占比例。三、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠時(shí)間的研究分別取雄性Period3基因敲除型純合子小鼠作為基因敲除(Per3-/-)組,雄性野生型小鼠作為空白對照組(WT),每組各8只。兩組小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境一周后,進(jìn)行小鼠皮層腦電電極和肌電電極的埋置。小鼠回復(fù)7天后描記小鼠EEG/EMG 5天(120小時(shí))。描記結(jié)束后,使用SleepSign 2.0分析。以10秒為一個(gè)單元分析EEG和EMG信號。分別計(jì)算每小時(shí)的NREMS/總睡眠所占比例的百分比,每小時(shí)的REMS/TS所占比例的百分比,每12小時(shí)(分白天-夜間)的NREMS/TS及REM/TS所占比例。四、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式變化機(jī)制的初步研究取Period3基因敲除型純合子小鼠及野生型小鼠各16只,每種基因型小鼠隨機(jī)分為4組,每組4只小鼠,適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境7天后,于第8天7：00開始,每6小時(shí)取小鼠下丘腦,每次分別取Period3基因敲除型純合子小鼠及野生型小鼠各一組。之后進(jìn)行每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Period3基因敲除型純合子小鼠及野生型小鼠下丘腦RNA與qRT-PCR的抽提實(shí)驗(yàn)以檢測AVP及DBP基因的表達(dá)。第三部分、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式及機(jī)制影響的初步研究一、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)的影響取16只雄性Period3基因敲除型純合子小鼠,經(jīng)皮層腦電電極和肌電電極的埋置手術(shù)處理,恢復(fù)7天后,將小鼠隨機(jī)分為給藥組及空白對照組,每組各8只。灌胃給予給藥組小鼠合歡花水煎液O.1mL/10g(10 g/kg),灌胃給予空白組小鼠相同體積的蒸餾水,連續(xù)給藥7天,第7天早7：00進(jìn)行給藥組及空白對照組小鼠的腦電及肌電描記實(shí)驗(yàn)。經(jīng)3天(72小時(shí))持續(xù)描記EEG/EMG后,以10秒(sec)為一個(gè)單元進(jìn)行EEG和EMG信號的分析,判斷覺醒(wake)、NREM睡眠和REM睡眠,并繪制睡眠時(shí)相序列圖(hypnogram)。二、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠覺醒時(shí)相的影響研究取16只雄性Period3基因敲除型純合子小鼠,經(jīng)皮層腦電電極和肌電電極的埋置手術(shù)處理,恢復(fù)7天后,將小鼠隨機(jī)分為給藥組及空白對照組,每組各8只。灌胃給予給藥組小鼠合歡花水煎液0.1 mL/10 g (10 g/kg),灌胃給予空白組小鼠相同體積的蒸餾水,連續(xù)給藥7天,第7天早7：00進(jìn)行給藥組及空白對照組小鼠的腦電及肌電描記實(shí)驗(yàn)。經(jīng)3天(72小時(shí))持續(xù)描記EEG/EMG后,以10秒(sec)為一個(gè)單元進(jìn)行EEG和EMG信號的分析。分別計(jì)算各時(shí)期(覺醒、NREMS、REMS)的持續(xù)時(shí)間。同時(shí)分別計(jì)算每小時(shí)的覺醒及各個(gè)睡眠時(shí)相所占的百分比。分別計(jì)算3天的覺醒及睡眠各時(shí)相平均成一天內(nèi)的每小時(shí)各個(gè)時(shí)相的持續(xù)時(shí)間百分比。分別計(jì)算每12小時(shí)時(shí)段(白天-夜間)的覺醒及各睡眠時(shí)相。分別計(jì)算每小時(shí)、每12小時(shí)(白天-夜間)的總睡眠次數(shù),并將3天的每一小時(shí)的睡眠次數(shù)平均為24小時(shí)每小時(shí)的睡眠次數(shù),以及白天時(shí)段-夜間時(shí)段的睡眠總次數(shù)。使用SleepSign 2.0分析NREM睡眠期EEG的δ波能量,計(jì)算每一小時(shí)NREMS δ波的能量及同天24 hNREM睡眠平均的δ波能量(計(jì)算成100%的6波活動(dòng)),將二者相比,計(jì)算出每小時(shí)δ波活動(dòng)的所占比例。三、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠時(shí)間的影響研究取16只雄性Period3基因敲除型純合子小鼠,經(jīng)皮層腦電電極和肌電電極的埋置手術(shù)處理,恢復(fù)7天后,將小鼠隨機(jī)分為給藥組及空白對照組,每組各8只。灌胃給予給藥組小鼠合歡花水煎液0.1m L/10 g (10 g/kg),灌胃給予空白組小鼠相同體積的蒸餾水,連續(xù)給藥7天,第7天早7：00進(jìn)行給藥組及空白對照組小鼠的腦電及肌電描記實(shí)驗(yàn)。經(jīng)3天(72小時(shí))持續(xù)描記EEG/EMG后,以10秒(sec)為一個(gè)單元進(jìn)行EEG和EMG信號的分析。分別計(jì)算每小時(shí)的NREMS/總睡眠所占比例的百分比,每小時(shí)的REMS/TS所占比例的百分比,每12小時(shí)(分白天-夜間)的NREMS/TS及REM/TS所占比例。四、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式變化影響機(jī)制的初步研究取雄性Period3基因敲除型純合子小鼠16只,隨機(jī)分為給藥組及空白對照組,每組各8只。適應(yīng)環(huán)境7天后,灌胃給予給藥組小鼠合歡花水煎液0.1 mL/10 g(10g/kg),灌胃給予空白對照組小鼠同體積的蒸餾水,灌胃時(shí)間為每天早7：00,每組連續(xù)給藥7天,于第7天給藥2小時(shí)后將小鼠斷頭取腦,大腦取出后置于冰板上并剝離出下丘腦,于-80℃冰箱中保存。最后,進(jìn)行抽提RNA與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測AVP和DBP基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：第一部分、Period3基因敲除型純合子小鼠的繁育與子代鼠的基因鑒定通過PCR基因鑒定表明,自行繁殖的Period3基因敲除型純合子(Per3-/-)小鼠及野生型純合子(Per3+/+)小鼠有穩(wěn)定的基因型。通過飼養(yǎng)觀察,每種基因型小鼠的表型、子代生產(chǎn)量、生長、存活率均是正常的。第二部分、Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式及機(jī)制的初步研究一、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠結(jié)構(gòu)的研究野生型小鼠與Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠覺醒節(jié)律及結(jié)構(gòu)相似。通過睡眠時(shí)相序列圖可以看出開燈后,兩種基因型之間的睡眠清醒狀態(tài)有些差異,但大部分的時(shí)間兩種基因型小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)看不出明顯的差異。二、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠覺醒時(shí)相的研究與野生型小鼠相比,每天第一小時(shí)(ZTO)PPeriod3基因敲除型純合子小鼠清醒時(shí)間的百分比較多,NREM睡眠時(shí)間少,兩者間具有顯著差異，Period3基因敲除型純合子小鼠入睡延遲；大部分白天時(shí)間,Period3基因敲除型純合子小鼠的REM睡眠較多,但沒有顯著性差異；5天的各個(gè)清醒睡眠參數(shù)平均成1天的結(jié)果顯示與5天的結(jié)果有相似；分別計(jì)算睡眠時(shí)相所占比例后可以看出,與野生型小鼠相比,Period3基因敲除型純合子小鼠的清醒時(shí)間較多、睡眠時(shí)間減少、NREM睡眠較少、白天的REM睡眠較多,但沒有顯著性差異；與野生型小鼠相比,Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠片斷在開燈后第一小時(shí)(ZTO)較少；同時(shí)ZT0 NREM的δ活動(dòng)較少,具有顯著差異；與野生型小鼠相比,Period3基因敲除型純合子小鼠在夜初時(shí)睡眠時(shí)間較多,同時(shí)NREM的6波活動(dòng)也較多,但都無顯著性差異。三、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠時(shí)間的研究與野生型小鼠相比,Period3基因敲除型純合子小鼠的總體睡眠時(shí)相、時(shí)間、以及所占比例無變化,兩者間沒有顯著性的差異；與野生型小鼠相比,Period3基因敲除型純合子小鼠在白天有些時(shí)間點(diǎn)的NREMS/TS較少、REMS/TS較多；在夜晚初時(shí),Period3基因敲除型純合子小鼠的NREMS/TS及REMS/TS匕野生型小鼠有增多的趨勢,有些時(shí)間點(diǎn)REM睡眠有顯著差異。在睡眠中明顯的是白天的NREMS/TS所占比例較少,具有顯著差異。Period3基因敲除型純合子小鼠的REM睡眠有增多的趨勢,但沒有顯著性的差異。四、Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式變化機(jī)制的初步研究與野生型鼠相比,Per3基因敲除鼠的A VP基因表達(dá)模式有表達(dá)量較高的趨勢,在夜間ZT 12及ZT18點(diǎn)AVP表達(dá)水平具有顯著差異(P0.05)。并且Per3基因敲除小鼠的AVP表達(dá)節(jié)律無顯著性的延遲差異。Per3基因敲除小鼠的D6p基因表達(dá)模式與野生型鼠相比,在ZT18點(diǎn)的D6p表達(dá)水平較低具有顯著差異(P0.05),表達(dá)節(jié)律有無明顯的前進(jìn)趨勢。第三部分、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式及機(jī)制影響的初步研究一、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)的影響研究以10秒為一個(gè)單元,描繪清醒、NREM睡眠及REM睡眠標(biāo)成睡眠時(shí)相序列圖。通過睡眠時(shí)相序列圖可以觀察到有些給藥組小鼠的睡眠覺醒節(jié)律及結(jié)構(gòu)與空白組有差異,睡眠狀態(tài)增加,有些小鼠REM睡眠減少。二、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠覺醒時(shí)相的影響研究與空白組相比,給藥組小鼠在日初時(shí)的覺醒所占比例減少,NREM睡眠所占比例增加,REM睡眠的所占比例無變化。連續(xù)三天的結(jié)果表明,合歡花水煎液有改善Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠節(jié)律的作用。與空白組相比,給藥組白天的NREM睡眠所占比例增加,兩者間存在顯著差異,但給藥組白天的NREM δ活動(dòng)無顯著差異；與空白組相比,給藥組小鼠睡眠次數(shù)增加,NREM睡眠時(shí)間增加,清醒時(shí)間減少,而NREM的6波活動(dòng)無變化；第3天的夜間結(jié)果顯示,與空白組相比,給藥組小鼠的清醒時(shí)間比第1天增多,但兩者間無顯著差異。三、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠時(shí)間的影響研究與空白組相比,給藥組小鼠每小時(shí)的NREMS/TS增加,REMS/TS減少,但大部分無顯著性的差異；與空白組相比,給藥組小鼠白天ZTO的NREMS/TS比例增加,兩者間存在顯著差異；與空白組相比,給藥組在夜晚初的NREMS/TS及REMS/TS比例都增多,但兩者間無顯著性差異。與空白組相比,給藥組小鼠第2天的白天NREMS/TS所占比例增加,第1天的白天REMS/TS所占比例減少。此外,將3天的實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均成1天表明,與空白組相比,給藥組白天的NREMS/TS所占比例增加。四、合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式變化影響機(jī)制的初步研究與空白組相比,給藥組小鼠下丘腦中DBP基因表達(dá)水平升高,兩者間具有顯著性差異；與空白組相比,給藥組小鼠下丘腦中AVP基因表達(dá)水平升高,但兩者間無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：1.Period3基因敲除型純合子小鼠在白天第一小時(shí)覺醒時(shí)間較多NREM睡眠時(shí)間及NREM δ波活動(dòng)較少,入睡較晚。白天的清醒時(shí)間及REM睡眠較多、NREM睡眠較少。2.Period3基因的作用機(jī)制可能是有關(guān)生物鐘基因與行為活動(dòng)的激發(fā)驅(qū)動(dòng)相互作用,以響應(yīng)明暗周期,及下丘腦中Period3基因調(diào)控AVP基因表達(dá)有關(guān)。3.合歡花水煎液對Period3基因敲除型純合子小鼠的睡眠模式有影響,具體表現(xiàn)在合歡花水煎液減少Period3基因敲除型純合子小鼠日初的清醒時(shí)間,增加NREM睡眠時(shí)間,使小鼠入睡更早。減少12小時(shí)白天-夜晚的清醒時(shí)間,以及增加NREM睡眠時(shí)間及白天NREMS/TS所占比例。4.合歡花水煎液能夠增加小鼠下丘腦的D6p基因表達(dá)水平,這可能是合歡花水煎液改變Period3基因敲除型純合子小鼠睡眠模式的機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5

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本文編號：2465288