【摘要】：【研究背景及目的】結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤,轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是該病的主要死因,其轉(zhuǎn)移機制已成為目前的研究熱點。近年來,越來越多研究表明上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對結(jié)直腸癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的增強發(fā)揮關(guān)鍵作用。Martin等學(xué)者研究表明,三聯(lián)組氨酸結(jié)合蛋白2(Histidine triad nucleotide-binding 2,HINT2)對腫瘤組織的生長起抑制作用,且該蛋白可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌組織中HINT2表達量明顯低于正常結(jié)腸組織,且HINT2對SW480結(jié)腸癌細胞的遷移、侵襲能力具有抑制作用。因此,本課題的目的是探究HINT2在結(jié)直腸癌細胞EMT中的作用,并探討相關(guān)的分子機制�！緦嶒灧椒ā�1.建立穩(wěn)定沉默HINT2的SW480細胞系將結(jié)腸癌細胞系SW480感染重組慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles(sc-92707-V)的方法敲除HINT2,并用有限稀釋克隆法建立穩(wěn)定沉默細胞系。2.檢測HINT2對SW480結(jié)腸癌細胞株EMT的影響2.1.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles感染結(jié)直腸癌細胞株SW480,下調(diào)細胞株中HINT2表達,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化,利用Western blot方法檢測HINT2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達量變化情況。2.2.構(gòu)建包含E-cadherin啟動子結(jié)合位點的報告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480細胞株,通過檢測熒光素酶表達水平預(yù)測HINT2對E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用。3.觀察HINT2變化對SW480結(jié)直腸癌細胞株遷移及侵襲能力的影響用細胞劃痕試驗及Transwell試驗檢測不同HINT2表達水平對SW480細胞遷移、侵襲能力的影響。4.探討HINT2抑制SW480細胞EMT的分子機制4.1.利用Real-time PCR檢測下調(diào)HINT2表達對SW480細胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、TWIST1、TWIST2表達的影響。4.2.制備HINT2與ZEB1雙干擾慢病毒HINT2+ZEB1 shRNA Lentiviral Particles。4.3.利用慢病毒Hint2 sh RNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A感染結(jié)腸癌細胞株SW480,利用Western blot方法檢測HINT2、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達量變化情況。4.4.構(gòu)建包含E-cadherin啟動子結(jié)合位點的報告基因質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入Hint2 shRNA(h)Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 sh RNA Lentiviral Particles或Control sh RNA Lentiviral Particles-A的SW480細胞株,通過檢測熒光素酶表達水平預(yù)測ZEB1在HINT2介導(dǎo)的E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用。5.統(tǒng)計學(xué)分析懫用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析,所有的結(jié)果都以均數(shù)±標準差表示,采用t檢驗,P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義�！緦嶒灲Y(jié)果】1.成功建立低表達HINT2的SW480細胞系。2.在SW480細胞中小干擾HINT2后,細胞形態(tài)由渾圓變得細長,出現(xiàn)梭形觸角,E-cadherin表達下降,N-cadherin、Vimentin表達量明顯上升。3.熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示HINT2通過轉(zhuǎn)錄水平促進E-cadherin表達。4.利用慢病毒載體下調(diào)HINT2表達后,細胞劃痕試驗及Transwell方法檢測結(jié)果顯示HINT2顯著抑制SW480細胞的侵襲、遷移能力。5.在SW480細胞中同時干擾HINT2及ZEB1后,EMT分子標記物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)表達量相較對照組無明顯變化。熒光素酶報告基因試驗結(jié)果顯示在SW480細胞中同時干擾HINT2及ZEB1,E-cadherin啟動子活性相較對照組未發(fā)生變化�！窘Y(jié)論】1.HINT2可抑制SW480結(jié)直腸癌細胞的EMT。2.HINT2可正性調(diào)控SW480結(jié)直腸癌細胞E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。3.HINT2可有效抑制結(jié)直腸癌細胞的遷移侵襲能力。4.ZEB1是低表達HINT2誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞EMT所必需的。5.低表達HINT2對E-cadherin轉(zhuǎn)錄活性的負性調(diào)控依賴于ZEB1表達
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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本文編號：2460972