【摘要】：嗜鹽菌由于其獨(dú)特的耐鹽堿代謝機(jī)制和遺傳特性已受到許多微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和土壤學(xué)研究工作者的廣泛關(guān)注,是一類極具基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值和發(fā)掘新的耐鹽堿機(jī)制的重要微生物資源,而對(duì)這類微生物新的耐鹽機(jī)制的研究還可以為改造農(nóng)作物、開(kāi)發(fā)微生物肥料、促進(jìn)糧食增產(chǎn)等提供重要的理論依據(jù)。肇東鹽單胞菌(Halomonas zhaodongensis)是一株分離自黑龍江省肇東鹽堿地的革蘭氏陰性輕度嗜鹽菌,它能在0-15%的S-G培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(最適鹽濃度為3%)。本研究借助大腸桿菌(Escherichia coli)鹽敏感突變株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),利用基因文庫(kù)篩選和功能互補(bǔ)相結(jié)合的技術(shù)方法,以發(fā)掘更多未知的耐鹽堿基因,并對(duì)它們所編碼的蛋白功能進(jìn)行研究。本研究利用含有0.2 M Na Cl的氨芐抗性固體培養(yǎng)基作為篩選工具,用以克隆肇東鹽單胞菌中潛在的與耐鹽堿有關(guān)的基因。實(shí)驗(yàn)共獲得21個(gè)能使KNabc突變株在0.2 M Na Cl的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng)能力的重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)酶切及測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)這21個(gè)重組質(zhì)粒中,包括一對(duì)屬于DUF1538(domain of unknown function with No.1538 family)家族的蛋白和一個(gè)屬于DUF2062家族(domain of unknown function with No.2062 family)的蛋白,它們的功能尚未被注釋,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它們均是與耐鹽有關(guān)的基因,本文將它們分別被命名為ump AB(unknown membrane protein)、duf2062。ump AB基因序列全長(zhǎng)1580 bp,由兩個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)組成,其中第一個(gè)閱讀框(ump A,765 bp)終止密碼子的最后一個(gè)堿基與第二個(gè)閱讀框(ump B,816 bp)起始密碼子的“A”堿基重疊在一起。它們編碼的蛋白序列分別由254個(gè)和271個(gè)氨基酸殘基組成,并將其分別命名為Hz_Ump A、Hz_Ump B(from Halomonas zhaodongensis)�？缒ゎA(yù)測(cè)分析也顯示,它們皆具有7個(gè)跨膜區(qū),它們和親緣關(guān)系最近的12個(gè)同系物有47個(gè)高度保守的氨基酸殘基,其中包括36個(gè)疏水性氨基酸、6個(gè)帶正電的氨基酸、5個(gè)極性氨基酸。同源比對(duì)顯示,Hz_Ump A和Hz_Ump B同屬于一個(gè)未知功能的DUF1538(domain of unknown function with No.1538family)蛋白家族,該家族在NCBI的Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中被定義為一類功能未知的、具有同一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域的蛋白集合,其發(fā)現(xiàn)順序?yàn)?538。更重要的是,Hz_Ump A和Hz_Ump B與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的其他蛋白沒(méi)有任何同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,它們與各自同源性在50%以上的同系物聚簇成闕值(bootstrap values)為96%和99%的兩個(gè)分支,但是與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的其他蛋白的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。除此之外,功能互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)揭示了ump AB基因具有一定的耐鹽堿能力,在0.4 M Na Cl或30 mM Li Cl的鹽脅迫下,ump AB能使鹽敏感突變株KNabc恢復(fù)生長(zhǎng),而單獨(dú)的ump A,ump B卻不能;當(dāng)Na Cl濃度為0-0.15 M時(shí),與負(fù)對(duì)照相比,單獨(dú)的Hz_Ump B具有一定的耐鹽能力,而單獨(dú)的Hz_Ump A在有鹽條件下生長(zhǎng)受到抑制;單獨(dú)的Hz_Ump A和Hz_Ump B具有一定程度的耐堿能力,且后者要好于前者。考慮到Hz_Ump B比Hz_Ump A多出一個(gè)親水的C末端,我們推測(cè)多出的這一親水C末端在其耐鹽堿過(guò)程中起到比較關(guān)鍵的作用。功能分析表明,Hz_Ump AB具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性,且這個(gè)活性具有一定的p H依賴性,其最適活性p H為9.0,對(duì)Na~+、Li~+、K~+三種離子的K0.5值分別是0.26±0.06 m M、0.46±0.09 m M、0.41±0.06 m M,換而言之,Hz_Ump AB對(duì)底物的偏好性是:Na~+K~+Li~+。為了進(jìn)一步研究Hz_Ump AB的細(xì)胞定位及二聚體鑒定,我們構(gòu)建了共表達(dá)載體p ETDuet-1-ump AB,運(yùn)用超離蛋白分級(jí)法對(duì)菌體的膜蛋白及胞漿蛋白進(jìn)行分離,Western Blot檢測(cè)顯示,Hz_Ump A和Hz_Ump B的蛋白條帶(約25 KDa)僅在全蛋白樣品和膜蛋白樣品中被檢測(cè)出來(lái),而且它們的確是大小不同的兩個(gè)蛋白,這就表明,Hz_Ump AB均定位于細(xì)胞質(zhì)膜。Co-IP顯示,在免疫沉淀Hz_Ump A蛋白時(shí),用Western Blot分析也能檢測(cè)到Hz_Ump B的蛋白條帶,表明Hz_Ump AB很可能是由兩個(gè)膜蛋白構(gòu)成的一個(gè)異源二聚體。duf2062基因序列全長(zhǎng)552 bp,可編碼的蛋白由183個(gè)氨基酸殘基組成,將其命名為Hz_DUF2062。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示,它可使鹽敏感突變株KNabc在0.3 M Na Cl或5 m M LiCl的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長(zhǎng),而且在偏堿性的環(huán)境中,其生長(zhǎng)能力要明顯好于負(fù)對(duì)照。這表明了該基因具有一定的耐鹽堿能力,且可能具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。跨膜預(yù)測(cè)分析顯示,Hz_DUF2062具有3個(gè)跨膜區(qū),和它們親緣關(guān)系最近的同系物有54個(gè)高度保守的氨基酸殘基,其中主要包括28個(gè)疏水性氨基酸、10個(gè)帶正電的氨基酸和13個(gè)極性氨基酸;同源比對(duì)表明,Hz_DUF2062屬于一個(gè)未知功能的DUF2062蛋白家族,而與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白沒(méi)有任何同源性。系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育學(xué)分析表明,Hz_DUF2062與同家族的其他蛋白聚集在一簇,闕值(bootstrap values)為91%,且此分支與已知的鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或具有鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。功能分析表明,Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性,以上活性具有pH依賴性,其最適活性p H為8.5,對(duì)Na~+、Li~+、K~+三種離子的K0.5值分別是0.2±0.13 mM、0.22±0.1 m M、0.43±0.08 m M,換而言之,Hz_DUF2062對(duì)底物的偏好性是:Na~+Li~+K~+。綜上所述,本研究首先對(duì)Hz_Ump AB和Hz_DUF2062兩個(gè)蛋白的功能進(jìn)行了注釋,首次報(bào)道了未知功能的DUF1538家族和DUF2062家族成員的確切功能,即代表DUF1538家族的蛋白對(duì)Hz_Ump AB和代表DUF2062家族的蛋白Hz_DUF2062具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性,同時(shí)還重點(diǎn)研究了Hz_Ump AB的細(xì)胞定位及這個(gè)異源二聚體的鑒定�；谝陨辖Y(jié)果,我們建議來(lái)自肇東鹽單胞菌(H.zhaodongensis)中的Hz_Ump AB蛋白對(duì)和Hz_DUF2062蛋白是兩個(gè)新型的Na~+(Li~+、K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。而且,我們也通過(guò)Co-IP首次揭示了鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的新結(jié)構(gòu),即鈉/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)除了同源二聚體和異源多聚體之外,還應(yīng)有像Hz_Ump AB這樣的異源二聚體結(jié)構(gòu)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q933;S156.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2454099