【摘要】：活性氧是植物抗病性的重要調(diào)控因子。目前已知的植物與病原物互作中產(chǎn)生活性氧的重要途徑有兩條,一是由NADPH氧化酶(Rboh基因編碼其亞基)催化產(chǎn)生超氧陰離子；另一條是由乙醇酸氧化酶(Glycolate oxidase, GOX)在光呼吸途徑中催化產(chǎn)生H2O2。最近有研究發(fā)現(xiàn),WRKY可能參與調(diào)控ETI(Effector-triggered immunity)和PTI(PAMP-triggered immunity)抗性和活性氧積累。許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病調(diào)控中發(fā)揮重要作用,但不同WRKY轉(zhuǎn)錄因子針對不同病原物的抗性有顯著區(qū)別。目前,擬南芥WRKY6在抗病性中的作用尚不明確,WRKY8在抗病中的研究也較少。這兩個WRKY對活性氧的調(diào)控作用還不明確。此外,GOX對不同病原物的調(diào)控作用區(qū)別明顯。本論文研究分析了兩個擬南芥WRKY基因AtWRKY6和AtWRKY8以及本氏煙GOX基因家族對菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum, Ss)和稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)抗性和活性氧積累的調(diào)控作用及機制。獲得的主要結(jié)果如下：(1)明確了AtWRKY6和AtWRKY8基因的抗病調(diào)控功能。利用敲除突變體和過表達轉(zhuǎn)基因植株的抗病分析結(jié)果表明,AtWRKY6和AtWRKY8基因在擬南芥對Ss的寄主抗性中均起正調(diào)控作用,但在對Xoo的非寄主抗性中卻起不同調(diào)控作用,AtWRKY6起正調(diào)控作用,而AtWRKY8基因卻起負調(diào)控作用。(2)闡明了AtWRKY6和AtWRKY8基因的抗病調(diào)控機理。敲除突變體和過表達轉(zhuǎn)基因植株的DAB染色結(jié)果表明,AtWRKY8正調(diào)控、而AtWRKY6基因負調(diào)控Xoo誘發(fā)的活性氧積累。qRT-PCR基因表達檢測結(jié)果表明,AtWRKY6和AtWRKY8基因在非接種時和接種Xoo后早期(6 hpi)通過調(diào)節(jié)RbohD、RbohF、GOXl和HAOXl基因表達調(diào)控Xoo誘發(fā)的活性氧積累。此外,利用敲除突變體和過表達轉(zhuǎn)基因植株的活性氧定量檢測分析結(jié)果顯示,AtWRKY6正調(diào)控細菌PAMP (flg22)激發(fā)的活性氧積累、卻負調(diào)控真菌PAMP (chitin)誘導(dǎo)的H2O2積累和擬南芥DAMP(AtPep1)誘發(fā)的活性氧積累；而AtWRKY8則負調(diào)控所有上述PAMP和DAMP激發(fā)的活性氧積累。說明AtWRKY6和AtWRKY8基因參與調(diào)控PTI和DTI抗性。苯胺藍染色分析發(fā)現(xiàn),AtWRKY6正調(diào)控、而AtWRKY8則負調(diào)控Ss侵染誘發(fā)的胼胝質(zhì)沉淀。過表達35S:WRKY6-9植株與wrky6突變體植株接種和不接種Ss的差異轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示,WRKY6通過調(diào)控包括SARD1、EDS1、EDS5、NIMIN-1、NIMIN-2、NPR2-5等在內(nèi)的SA轉(zhuǎn)運和信號傳導(dǎo)通路在基礎(chǔ)抗性中起重要作用,而面對Ss的侵染,WRKY6通過下調(diào)一組抗性負調(diào)控因子,包括MLO、EDR2、BON3、BAP和NUDT7,誘導(dǎo)對Ss的抗性,同時通過活化Rapid alkalinization factor (RALF)和GLP抵抗Ss產(chǎn)生大量草酸引起的強酸性,并通過負調(diào)控FLS2的降解因子PUB 12/24、chitin觸發(fā)PTI的關(guān)鍵因子LYM2、CERK1、BAK1和BIK1,以及PEP1-3及其受體PEPR2,分別正調(diào)控flg22激發(fā)的PTI、負調(diào)控chitin誘發(fā)的PTI以及AtPepl誘發(fā)的DTI。(3)利用生物信息學(xué)方法在基因組水平鑒定了本氏煙GOX基因家族,并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)分析明確了其中NbHAOX8、NbGOX1和NbGOX4對Ss和Xoo抗性的調(diào)控作用。獲得了16條本氏煙GOX基因序列。序列分析結(jié)果顯示,它們均包含一個alpha_hydroxyacid_oxid_FMN結(jié)構(gòu)域,與NCBI-CDD中的結(jié)構(gòu)域相比,該結(jié)構(gòu)域中第二個催化殘基之后含有一個大小為43～53個氨基酸的插入序列(NbHAOX3和NbHAOX6除外)。VIGS基因功能分析結(jié)果表明,NbGOX1和NbHAOX8基因負調(diào)控對Xoo的非寄主抗性,不顯著影響對Ss的抗性,而NbGOX4基因則正調(diào)控對Xoo的非寄主抗性以及對Ss的寄主抗性。(4)初步明確了本氏煙GOX基因的抗病調(diào)控機理。DAB染色結(jié)果顯示,NbHAOX8和NbGOX1 VIGS植株中Xoo誘導(dǎo)的活性氧積累高于eGFP植株,而NbGOX4 VIGS植株中活性氧積累量卻少于eGFP。表明NbGOX1和NbHAOX8基因負調(diào)控,而NbGOX4則正調(diào)控Xoo誘導(dǎo)的活性氧積累。定量檢測結(jié)果顯示,這三個基因均負調(diào)控細菌PAMP (flag22)誘導(dǎo)的活性氧積累。這三個基因不顯著改變RbohD和RbohF基因的表達,說明它們對活性氧的調(diào)控與RbohD和RbohF基因的調(diào)控作用相互獨立。此外,NbGOX4的沉默顯著提高了其它兩個基因的表達,表明NbGOX4可能通過調(diào)節(jié)NbHAOX8和NbGOX1發(fā)揮其調(diào)控功能。此外,NbGOX1可能通過SA途徑、NbGOX4可能通過JA和WRKY45和WRKY62介導(dǎo)的途徑調(diào)控植物抗病性；而NbHAOX8則可能通過其它未知途徑調(diào)控植物抗病性。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S432.23
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本文編號：2446250