【摘要】：玉米是世界三大食糧作物之一,同時(shí)也是重要的工業(yè)原料,其產(chǎn)量和品質(zhì)對人類有著至關(guān)重要的意義。在眾多影響農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的逆境因素中,干旱無疑是很常見且影響甚大的一種逆境脅迫,是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要問題。干旱脅迫對玉米生長發(fā)育的影響十分巨大。我國是個(gè)缺水嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)國家,尤其是西北部地區(qū),在沒有有效灌溉方法的情況下,農(nóng)作物長期處于干旱脅迫中。所以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)去提高玉米品種的抗旱能力是減少干旱對玉米產(chǎn)量和品質(zhì)影響的快捷有效的途徑。根系是植物的重要器官,主要作用是吸收水分和養(yǎng)料以及合成必需的激素。玉米的根系發(fā)達(dá)與否和其抗旱能力強(qiáng)弱有直接關(guān)系,從而影響玉米的莖葉等地上部位以及最終產(chǎn)量的構(gòu)成。細(xì)胞分裂素與植物長發(fā)育有密切聯(lián)系,其代謝途徑中的關(guān)鍵酶是細(xì)胞分裂素氧化酶(CKX),它可調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素在植物體內(nèi)的含量,進(jìn)而調(diào)控植物的各部分組織器官的生長發(fā)育情況。本研究選擇一種水稻根特異性表達(dá)基因EXP18D啟動(dòng)子與CKX基因相連后,對玉米自交系進(jìn)行轉(zhuǎn)化,從而促進(jìn)其根系的生長發(fā)育,以期獲得耐旱玉米品種。本研究采用花粉管通道法將AtCKX3基因?qū)胗衩鬃越幌�。�?jīng)過對T0代、T1代以及T2代進(jìn)行草甘膦除草劑噴灑的初步篩選,獲得130個(gè)具有草甘膦抗性的轉(zhuǎn)基因純合株系。然后接著對T2代純合株系進(jìn)行耐旱鑒定,選出耐旱能力較強(qiáng)的10個(gè)轉(zhuǎn)基因株系,然后通過分子檢測的方法和一些常規(guī)根系測量指標(biāo)去證明抗草甘膦除草劑基因EPSP以及目的基因CKX3已成功的導(dǎo)入C92、2416、572等玉米自交系的基因組中,且能夠穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。測定干旱處理過的轉(zhuǎn)基因株系和C92、2416自交系的株高、葉面積,千粒重等生理指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo),結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)CKX3基因株系各項(xiàng)指標(biāo)都明顯優(yōu)于C92等自交系。另外,還對8個(gè)自交系572的T4代高代純合轉(zhuǎn)基因株系和572自交系的苗期根系相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行了測定,結(jié)果表明CKX3基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因純合株系的耐旱性相比自交系而言有所提高�；谖⒌问綌�(shù)字PCR平臺,以轉(zhuǎn)基因玉米為例,建立了轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)分析方法,對待測樣品進(jìn)行了快速鑒定,并從T0代轉(zhuǎn)基因玉米株系中鑒定出多個(gè)單拷貝單株。對該方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在分析結(jié)果的準(zhǔn)確性方面進(jìn)行了比較,從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出,兩種檢測方法的結(jié)果比較一致,單拷貝檢測結(jié)果高度一致;但是ddPCR試驗(yàn)操作更加簡便,試驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性強(qiáng),試驗(yàn)數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確可靠。研究表明,ddPCR方法是一種更加便捷、快速和準(zhǔn)確的外源基因拷貝數(shù)分析新方法,基于其在準(zhǔn)確性和靈敏度方面的顯著優(yōu)勢,將會在轉(zhuǎn)基因作物的外源基因拷貝數(shù)分析中得到廣泛的應(yīng)用。
[Abstract]:Corn is one of the three major food crops in the world, and it is also an important industrial raw material. Its yield and quality are of vital importance to human beings. Among the many adversity factors affecting crop yield and quality drought is undoubtedly a common and influential adversity stress which is an important problem restricting agricultural production. The effects of drought stress on the growth and development of maize were very great. China is an agricultural production country with serious water shortage, especially in northwest China. Without effective irrigation methods, crops are in drought stress for a long time. Therefore, using transgenic technology to improve drought resistance of maize varieties is a quick and effective way to reduce the effect of drought on maize yield and quality. Root system is an important organ of plants. Its main function is to absorb water and nutrients and synthesize essential hormones. Whether the root system is developed or not is directly related to the drought resistance ability of maize, which affects the composition of the upper ground parts of maize such as stem and leaf, as well as the final yield. Cytokinin is closely related to plant growth and development. The key enzyme in its metabolic pathway is cytokinin oxidase (CKX), which can regulate the content of cytokinin in plants. And then regulate the growth and development of each part of plant tissues and organs. In this study, a rice root-specific expression gene, EXP18D promoter, was linked to the CKX gene and transformed into maize inbred lines to promote the growth and development of their roots, with a view to obtaining drought-tolerant maize varieties. In this study, AtCKX3 gene was introduced into maize inbred lines by pollen tube pathway. After spraying glyphosate herbicide on T _ 0, T _ 1 and T _ 2 generations, 130 transgenic homozygous lines with glyphosate resistance were obtained. Then, the T _ 2 homozygous lines were identified for drought tolerance, and 10 transgenic lines with strong drought tolerance were selected. Then it was proved that glyphosate-resistant herbicide gene EPSP and target gene CKX3 had been successfully introduced into the genome of maize inbred lines C92, 2416572 by molecular detection and some routine root measurements, and the gene could be inherited and expressed stably. The physiological and yield indexes such as plant height, leaf area, 1000-grain weight and so on in drought-treated transgenic lines and C92, 2416 inbred lines were determined. The results showed that the CKX3 transgenic lines were obviously superior to C92 inbred lines in each index. In addition, eight inbred lines (572) with T _ 4 homozygous transgenic lines and 572 inbred lines at seedling stage were tested. The results showed that the drought tolerance of transgenic homozygous lines with over-expression of CKX3 gene was higher than that of inbred lines. The results showed that the drought tolerance of transgenic homozygous lines with higher T _ 4 generation and 572 inbred lines was higher than that of inbred lines. Based on the micro-drop digital PCR platform, a copy number analysis method of foreign genes in transgenic maize was established, and the samples were identified quickly. Several single copies of transgenic maize lines were identified from T _ 0 generation transgenic maize lines, and a single copy analysis method for transgenic maize plants was established, and several single copy single plants were identified from the T _ 0 generation transgenic maize lines. The accuracy of the method is compared with that of real-time fluorescence quantitative PCR. From the experimental data, it can be seen that the results of the two methods are relatively consistent, and the results of single copy detection are highly consistent. But the ddPCR test operation is more simple, the test results are repeatable, and the test data are more accurate and reliable. Studies have shown that ddPCR is a more convenient, rapid and accurate method for the analysis of foreign gene copy numbers, which is based on its significant advantages in accuracy and sensitivity. It will be widely used in the analysis of foreign gene copy number in transgenic crops.
【學(xué)位授予單位】：長江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S513

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本文編號：2434536