【摘要】：本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因克隆、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等方法,研究了prestin基因在各組織中的表達(dá)和差異,對(duì)該基因不同轉(zhuǎn)錄變異體對(duì)應(yīng)的不同啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了深入分析,并結(jié)合生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)了相關(guān)順式調(diào)控元件和調(diào)控因子,獲得以下結(jié)果：(1)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量對(duì)prestin基因在大腦、睪丸和耳蝸中總體表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)prestin除了在耳蝸中特異性高表達(dá)外,在小鼠睪丸和大腦中也有表達(dá)。隨后檢測(cè)了prestin基因轉(zhuǎn)錄變異體1表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)除了耳蝸外,大腦和睪丸中同樣存在著不同的轉(zhuǎn)錄變異體表達(dá),轉(zhuǎn)錄變異體1在耳蝸、大腦和睪丸組織中分別占總表達(dá)量的58.08%、43.77%、62.91%。(2)通過(guò)分析prestin基因已知的3種：mRNA序列,針對(duì)不同轉(zhuǎn)錄變異體設(shè)計(jì)了特異性片段擴(kuò)增,定性的研究該基因不同轉(zhuǎn)錄變異體的表達(dá),發(fā)現(xiàn)耳蝸、大腦、睪丸、GC-1spg細(xì)胞中prestin基因均有轉(zhuǎn)錄本1的表達(dá),在耳蝸中也擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄變異體2或3。結(jié)合5'RACE實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增出睪丸中prestin基因mRNA的5’端序列,發(fā)現(xiàn)prestin基因在睪丸中表達(dá)轉(zhuǎn)錄變異體2或3,但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他未知的轉(zhuǎn)錄變異體。(3)通過(guò)克隆prestin基因5’端DNA序列,構(gòu)建了啟動(dòng)子1和啟動(dòng)子2缺失片段載體,運(yùn)用雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng),檢測(cè)啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子1在GC-1spg小鼠精原細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性較低,而啟動(dòng)子2的轉(zhuǎn)錄活性較高。第一外顯子上游-280bp到-765bp以內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,-765bp到-1096bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控元件,第二外顯子上游-952bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)控元件,-952bp到-1954bp內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控元件。(4)結(jié)合生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)了上述調(diào)控區(qū)潛在的大量轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子GATA-3,-2,-1潛在的結(jié)合位點(diǎn),結(jié)合已有報(bào)道,推測(cè)其可能在小鼠精原細(xì)胞中調(diào)控prestin基因的表達(dá)。本研究分析了prestin基因在耳蝸、睪丸和大腦中的表達(dá),檢測(cè)了啟動(dòng)子各區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性,為下一步闡明該基因的特異性表達(dá)調(diào)控模式奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study, real-time quantitative PCR, gene cloning and double-luciferase reporting assay were used to study the expression and difference of prestin gene in various tissues. The transcriptional activities of different promoters corresponding to different transcriptional variants of the gene were analyzed, and the related cis-regulatory elements and regulatory factors were predicted by bioinformatics. The following results were obtained: (1) the total expression of prestin gene in the brain, testis and cochlea was detected by real-time fluorescence quantitative analysis. It was found that prestin was expressed not only in the cochlea but also in the testis and brain of mice. Then we detected the expression of transcription variant 1 of prestin gene, and found that in addition to cochlea, there were different expression of transcription variant 1 in the brain and testis, and transcription variant 1 was in the cochlea. Brain and testicular tissue accounted for 58.08%, 43.77%, 62.91% of the total expression respectively. (2) by analyzing three known prestin genes: mRNA sequences, specific fragments were designed for different transcription variants. Qualitative study on the expression of prestin gene in cochlea, brain, testis and GC-1spg cells showed that transcript 1 was expressed in cochlea, brain, testis and transcription variant 2 or 3. The 5'- terminal sequence of prestin gene mRNA was amplified by 5'RACE assay. It was found that prestin gene expressed transcription variant 2 or 3 in testis, but no other unknown transcription variants were found. (3) the 5'- terminal DNA sequence of prestin gene was cloned. Promoter 1 and promoter 2 deletion vectors were constructed. The transcriptional activity of promoter 1 was detected by double luciferase reporting system. It was found that promoter 1 had low transcriptional activity in spermatogonia of GC-1spg mice. The transcriptional activity of promoter 2 was higher. There were transcriptional regulatory elements in-280bp to-765bp in the upstream of exon 1, regulatory elements in-765bp to-1096bp and regulatory elements in-952bp in the upstream of exon 2, and transcription-activated elements in-952bp in the upstream of exon 2, and transcription-activated elements in-765bp to-1096bp in the upstream of exon 1. There are regulatory elements of transcription inhibition in-952bp to-1954bp. (4) binding bioinformatics analysis predicted a large number of potential transcription factor binding sites in these regulatory regions, and found the potential binding sites of transcriptional regulatory factor GATA-3,-2,-1. It has been reported that it may regulate the expression of prestin gene in mouse spermatogonia. In this study, the expression of prestin gene in cochlea, testis and brain was analyzed, and the transcriptional activity of the promoter region was detected, which laid a foundation for further elucidating the specific expression and regulation pattern of the gene.
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2432016