【摘要】：朵麗蝶蘭(Doritaenopsis hybrid)作為蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與朵麗蘭(Dorits)的雜交品種,是目前市場上應(yīng)用最多的商品蝴蝶蘭雜交品種之一。它以花期長,花形優(yōu)雅,色彩艷麗等特點(diǎn)深受人們喜愛。但是其開花需要經(jīng)歷一段18-25℃的相對低溫誘導(dǎo),所以溫度成為制約其開花上市的主要原因之一。探究溫度調(diào)控朵麗蝶蘭開花時(shí)間的分子機(jī)制,是克服溫敏現(xiàn)象的關(guān)鍵科學(xué)問題。本研究以朵麗蝶蘭為材料,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建DhMIR172干涉載體,為后續(xù)朵麗蝶蘭的遺傳轉(zhuǎn)化做準(zhǔn)備。利用RACE技術(shù)克隆DhMIR172候選靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3。為進(jìn)一步明確DhMIR172及其靶基因在朵麗蝶蘭低溫成花過程中的重要作用與調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:1、DhMIR172的RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)RNA干擾原理,利用本實(shí)驗(yàn)室已克隆的DhMIR172序列設(shè)計(jì)Gateway引物,PCR擴(kuò)增后引入定向連接位點(diǎn)。通過pENTRTM Directional TOPO(?) Cloning Kits試劑盒構(gòu)建入門載體,再將目的序列定向轉(zhuǎn)移至表達(dá)載體pHELLAGATE8,構(gòu)建DhMIR172 基因 RNA 干擾表達(dá)載體 pHELLAGATE8-DhMIR172。以朵麗蝶蘭0908原球莖為外植體,用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化,以300 mg/L的羧芐青霉素抑制農(nóng)桿菌生長,壯觀霉素抗性培養(yǎng)基篩選再生苗,驗(yàn)證所構(gòu)建的RNA干涉載體的表達(dá)效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),恢復(fù)培養(yǎng)一星期后,農(nóng)桿菌爆發(fā),原球莖開始褐化;恢復(fù)培養(yǎng)兩星期后,原球莖全部褐化死亡。未得到轉(zhuǎn)基因植株。2、靶基因DhAP2-1、DhAP2-2、DhAP2-3全長克隆從小蘭嶼蝴蝶蘭數(shù)據(jù)庫中BLAST得到三個(gè)DhMIR172候選靶基因(DhAP2-1、DhAP2-2和DhAP2-3),以朵麗蝶蘭cDNA為模板分別克隆靶基因全長。本實(shí)驗(yàn)室已克隆得到DhAP2-1中間片段,分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行3'RACE和5'RACE全長克隆,選取5'端片段,3'端片段以及中間片段進(jìn)行基因全長拼接,得到2220bp的朵麗蝶蘭DhMIR172靶基因DhAP2-1全長cDNA,含有一個(gè)1479 bp的ORF區(qū),編碼492個(gè)氨基酸,含有兩個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域和DhMIR172結(jié)合位點(diǎn)。利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增靶基因 DhAP2-2 和DhAP2-3, DhAP2-2 cDNA 全長 1038bp,含有一個(gè) 1038 bp 的ORF區(qū),編碼345個(gè)氨基酸,含有兩個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域。DhAP2-3 cDNA全長738bp,含有一個(gè)738 bp的ORF區(qū),編碼245個(gè)氨基酸,含有一個(gè)AP2保守結(jié)構(gòu)域。3、雙熒光素酶檢測DhMIR172與候選靶基因的互作關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)主要檢測共轉(zhuǎn)野生型克隆AP2-WT過表達(dá)載體和miR172 mimic,共轉(zhuǎn)突變型克隆AP2-MUTA過表達(dá)載體和miR172 mimic到293 T細(xì)胞后,檢測熒光素酶活性。同時(shí)以共轉(zhuǎn)野生型克隆AP2-WT過表達(dá)載體和NC mimic,共轉(zhuǎn)突變型克隆AP2-MUTA過表達(dá)載體和NC mimic,做為對照組進(jìn)行比較分析。在轉(zhuǎn)染重組載體質(zhì)粒AP2-1-WT的實(shí)驗(yàn)中,與miR172NC組比較,miR172組熒光素酶活性顯著下降,。轉(zhuǎn)染重組載體質(zhì)粒AP2-1-MUTA的實(shí)驗(yàn)中,各組熒光素酶活性表達(dá)均無顯著差異。DhAP2-1與miR172之間在mRNA水平存在明顯的互作關(guān)系。
[Abstract]:As a hybrid variety of Phalaenopsis (Phalaenopsis) and (Dorits), (Doritaenopsis hybrid) is one of the most widely used commercial Phalaenopsis hybrids in the market. It is popular with the characteristics of long flowering period, elegant flower shape, bright color and so on. However, its flowering needs a relatively low temperature of 18-25 鈩，

本文編號：2428622