【摘要】：干擾素是一類由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,具有廣譜抗病毒、抗菌、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種生物活性,是構(gòu)成機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要成分。IFIT1 (Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的受干擾素調(diào)控基因表達(dá)的ISGs蛋白,能夠通過(guò)多種方式參與并調(diào)控機(jī)體的生理活動(dòng)。本研究選擇人的IFIT1編碼基因HIFIT1 (GenBank登錄號(hào)：BC007091.1)及小鼠的IFIT1編碼基因mifit1 (GenBank登錄號(hào)：CT010226.1)進(jìn)行克隆表達(dá)和制備抗體。HIFIT1基因的開放閱讀框(ORF)為1437 bp,編碼一條含478個(gè)氨基酸、分子量為55.36 kDa的多肽鏈。而mifit1基因ORF為1392 bp,編碼一條含463個(gè)氨基酸、分子量為53.74 kDa的多肽鏈。提取人的293T細(xì)胞及鼠的3T3細(xì)胞總RNA后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR分別擴(kuò)增得到HIFIT1和mifit1完整的ORF,將這兩個(gè)ORFs分別插入到表達(dá)載體pGEX-4T-1上形成重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化入Escherichia coli DH5a細(xì)胞中,成功表達(dá)了重組的HIFIT1蛋白(rHIFIT1)和重組的MIFIT1蛋白(rMIFIT1),表觀分子量分別約為81 kDa和79 kDa,與它們作為GST融合蛋白的理論預(yù)測(cè)值相符。用這兩種重組蛋白分別腹腔注射免疫BALB/c小鼠和新西蘭兔,利用間接酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定免疫前后鼠血清及兔血清抗體水平的消長(zhǎng),結(jié)果表明3次免疫后所有免疫動(dòng)物血清中特異性IgG抗體滴度均達(dá)100以上。通過(guò)蛋白免疫印跡(Western Blot)分析,結(jié)果表明rHIFIT1免疫鼠血清能夠與293T細(xì)胞的天然HIFIT1蛋白相結(jié)合,rMIFIT1免疫兔血清能夠識(shí)別3T3細(xì)胞的天然MIFIT1蛋白,從而顯示rHIFIT1蛋白及rMIFIT1蛋白具有很好的免疫原性和反應(yīng)原性,能夠替代其相應(yīng)的天然蛋白作抗原制備抗體。利用間接免疫熒光抗體實(shí)驗(yàn)(IFAT)技術(shù)分別檢測(cè)天然HIFIT1蛋白在人293T細(xì)胞上的定位和MIFIT1蛋白在鼠3T3細(xì)胞上的定位顯示天然HIFIT1蛋白和MIFIT1蛋白均主要分布在相應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。將經(jīng)rHIFIT1蛋白免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,通過(guò)多次篩選得到9株抗rHIFIT1的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞,并制備獲得含有抗rHIFIT1抗體的小鼠腹水。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了HIFIT1和MIFIT1的原核表達(dá)系統(tǒng),并制備了HIFIT1的多克隆抗體、單克隆抗體及MIFIT1多克隆抗體,促進(jìn)了IFIT1蛋白分子生物學(xué)及免疫學(xué)方面的研究,為相關(guān)疾病的免疫診斷及免疫治療奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Interferon is a class of cytokines produced by monocytes and lymphocytes. It has many biological activities, such as broad-spectrum anti-virus, anti-bacterial, anti-tumor and regulating the immune function of the body. IFIT1 (Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1) is the first known ISGs protein regulated by interferon, which can participate in and regulate the physiological activities of the body in many ways. In this study, human IFIT1 encoding gene HIFIT1 (GenBank accession number: BC007091.1) and mouse IFIT1 encoding gene mifit1 (GenBank accession number: CT010226.1) were selected for cloning, expression and preparation of antibodies. The open reading frame (ORF) of HIFIT1 gene was 1437 bp,. Encode a polypeptide chain containing 478 amino acids with a molecular weight of 55.36 kDa. Mifit1 gene ORF 1392 bp, encodes a polypeptide containing 463 amino acids with a molecular weight of 53.74 kDa. The total RNA of human 293T cells and mouse 3T3 cells were extracted, and then amplified by reverse transcription PCR. HIFIT1 and mifit1 complete ORF, were inserted into the expression vector pGEX-4T-1 to form recombinant plasmids, which were transformed into Escherichia coli DH5a cells. The recombinant HIFIT1 protein (rHIFIT1) and the recombinant MIFIT1 protein (rMIFIT1) were successfully expressed, with apparent molecular weights of about 81 kDa and 79 kDa, respectively, which were consistent with their theoretical predicted values as GST fusion proteins. BALB/c mice and New Zealand rabbits were immunized with these two recombinant proteins intraperitoneally respectively. The levels of antibody in serum and rabbit serum were measured by indirect enzyme-linked adsorption assay (ELISA) before and after immunization. The results showed that the titers of specific IgG antibody in serum of all immunized animals were above 100 after three times of immunization. Western blot (Western Blot) analysis showed that rHIFIT1 immunized rat serum could bind to the natural HIFIT1 protein of 293T cells, and rMIFIT1 immunized rabbit serum could recognize the natural MIFIT1 protein of 3T3 cells. The results showed that rHIFIT1 protein and rMIFIT1 protein had good immunogenicity and reactivity, and they could be used as antigens to prepare antibodies instead of their natural proteins. The localization of natural HIFIT1 protein on human 293T cells and the localization of MIFIT1 protein on mouse 3T3 cells by indirect immunofluorescence antibody assay (IFAT) showed that the natural HIFIT1 protein and MIFIT1 protein were mainly distributed in the cytoplasm of the corresponding cells. The spleen cells of BALB/c mice immunized with rHIFIT1 protein were fused with SP2/0 cells of mouse myeloma cells. Nine strains of anti-rHIFIT1 hybridoma cells were obtained by multiple screening, and ascites containing anti-rHIFIT1 antibody were prepared. The prokaryotic expression systems of HIFIT1 and MIFIT1 were successfully constructed, and the polyclonal antibody, monoclonal antibody and MIFIT1 polyclonal antibody of HIFIT1 were prepared, which promoted the study of molecular biology and immunology of IFIT1 protein. It lays a foundation for immune diagnosis and immunotherapy of related diseases.
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2427888