【摘要】：目的檢測自噬調(diào)控基因mTORC1、mTORC2、Beclin1與多藥耐藥基因MDR-1在大腸癌患者癌組織中的水平,分析自噬對大腸癌多藥耐藥的影響;以人結(jié)直腸癌耐藥細胞株HCT-8/5-FU為研究對象,研究大腸癌中自噬調(diào)控基因mTORC1,mTORC2及Beclin1的表達對大腸癌耐藥的影響及其機制,探討mTORC1,mTORC2及Beclin1對大腸癌靶點治療及其化療的協(xié)同影響作用。材料與方法收集濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2006年01月至2010年01月手術(shù)治療的279例大腸癌患者組織和資料,所有患者都是首次發(fā)現(xiàn),術(shù)前沒有進行任何治療,術(shù)后所有患者進行了聯(lián)合治療。通過回訪中心和電話對所有病例進行隨訪。應(yīng)用免疫組化Envision法檢測279例大腸癌中mTORC1、mTORC2核心分子Raptor和Rictor以及mTOR、Beclin1、LC3和MDR-1的表達,采用χ2檢驗分析各蛋白與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性;運用Kaplan-Meier統(tǒng)計學(xué)方法探討結(jié)直腸癌患者預(yù)后的影響因素。使用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制HCT-8/5-FU細胞株中Beclin1的表達,分別用雷帕霉素、KU0063794和5-FU聯(lián)合干預(yù)HCT-8/5-FU細胞株,分別用RT-PCR和Western blot實驗在RNA和蛋白水平檢測各組細胞LC3-II、NF-kB、MDR-1、Bcl-2、Bax、MDR-1、Cleavage Caspase-3、CyclinDl 的表達,平板克隆實驗、CCK-8檢測細胞增殖活性,Transwell評估腫瘤侵襲能力,MDC染色顯示自噬水平,Hoechst33342檢測細胞凋亡。選擇健康BALB/c裸鼠,皮下種植瘤細胞,觀察裸鼠成瘤情況,每天腹腔注射雷帕霉素、KU0063794及5-FU, 4周后處死裸鼠后取移植瘤分析,并且分別用免疫組化、RT-PCR和Western blot實驗在RNA和蛋白水平檢測移植瘤組織中MDR-1、LC3-Ⅱ, NF-kB的表達。結(jié)果大腸癌標本中Beclin1、LC3、mTOR、Raptor、Rictor和MDR-1的陽性率分別為 90.32%、87.09%、46.23%、42.65%、62.72%和 72.75%,較正常組織均增加。LC3蛋白在中+低分化大腸癌中的表達高于高分化大腸癌,mTOR、Raptor、Rictor、LC3在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組;Beclin1水平升高與分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性。LC3和Beclin1、Rictor水平具有正相關(guān)性,與Raptor、mTOR水平具有負相關(guān)性,Beclin1與mTOR水平無明顯相關(guān)性。Raptor與Rictor的水平具有負相關(guān)性。MDR-1與Beclin1、LC3和Rictor的表達呈正相關(guān)表達,而Raptor與mTOR的表達呈負相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析顯示,Rictor、Beclin1、LC3均陽性,Raptor、mTOR、MDR-1均陰性,并且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌患者五年生存率大于Rictor、Beclin1、LC3均陰性,Raptor、mTOR、MDR-1均陽性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。干擾RNA有效抑制了 Beclin1基因在mRNA和蛋白水平的表達,并且顯著下調(diào)了 Bax、LC3-II和CleavageCaspase-3的表達,上調(diào)了 Bcl-2的表達。此外,抑制Beclin1分別在體外和體內(nèi)明顯增加了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲活性,減弱了腫瘤細胞凋亡活性,并且腫瘤細胞對5-FU的敏感性顯著降低。KU0063794有效抑制了 mTORC1和mTORC2,并且顯著上調(diào)了 LC3-II的表達,下調(diào)了NF-kB,MDR-1和CyclinD1的表達。此外,同時抑制mTORC1和mTORC2分別在體外和體內(nèi)明顯降低了腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲活性,增強了腫瘤細胞凋亡活性,并且腫瘤細胞對5-FU的敏感性顯著增高。結(jié)論1 Beclinl、Raptor與Rictor在大腸癌組織中水平升高,與大腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及生存密切相關(guān),對于判斷大腸癌患者的預(yù)后具有重要參考價值。2.大腸癌中MDR-1的表達與Beclin1、LC3、Raptor、Rictor密切相關(guān);檢測Beclin1、Rictor、Raptor蛋白表達,可為判斷大腸癌的多藥耐藥以及合理篩選有效的化療藥物提供新的理論依據(jù)。3.抑制自噬調(diào)控基因mTORC1、mTORC2的表達、增加Beclin1的表達可以降低腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲活性,增強腫瘤細胞的凋亡,從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。4.靶向抑制mTORC1、mTORC2、上調(diào)Beclin1可逆轉(zhuǎn)腸癌細胞的耐藥性,可增加大腸癌靶點治療及常規(guī)化療的協(xié)同作用,對于提高大腸癌的臨床治療效果具有重要意義。
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【學(xué)位授予單位】：濱州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 吳淑華;胡金龍;何雙;溫菲菲;孫晨博;田東;;大腸癌中Beclin1、LC3和mTOR的表達及意義[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2014年12期

2 胡金龍;何雙;孫晨博;吳淑華;;自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3與大腸癌多藥耐藥性的相關(guān)性[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2014年02期

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本文編號：2423322