【摘要】：研究背景胰腺癌癥狀非特異,早期具有高侵襲轉(zhuǎn)移特性,是一種低切除率的實(shí)體腫瘤。因此,臨床醫(yī)生面臨的主要問題是許多不能切除的胰腺癌患者。到目前為止,由于其惡性程度高,對(duì)化療及放療不敏感,胰腺癌仍然缺乏有效的治療措施。一般來說,基于吉西他濱的化療進(jìn)展期胰腺癌患者中位生存期大約在6-8月。然而,從研究角度看,胰腺癌細(xì)胞維持生存機(jī)制研究的進(jìn)展說明化學(xué)治療仍是最有潛力的治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號(hào)途徑異常活化是胰腺癌進(jìn)展過程中主要事件。研究表明,Hh信號(hào)通路在胰腺癌中的激活是通過SHh基因上調(diào)及核轉(zhuǎn)錄因子Gli1調(diào)節(jié)下游靶基因最終實(shí)現(xiàn)的。對(duì)高轉(zhuǎn)移性胰腺癌細(xì)胞株中通過c DNA微陣列技術(shù)對(duì)Gli1靶基因進(jìn)行系統(tǒng)性研究,通過對(duì)靶基因仔細(xì)分析,發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路下游復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生存,并提示BIRC3能顯著抑制凋亡或許是一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。研究并闡明胰腺癌細(xì)胞中Gli1-依賴性BIRC3通路維持細(xì)胞生存的這一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的具體機(jī)制,對(duì)尋找胰腺癌可能的潛在治療靶點(diǎn)具有重要意義。研究目的:1.研究胰腺癌細(xì)胞中Hh信號(hào)通路關(guān)鍵元件過表達(dá)及抑制情況下BIRC3的變化,探討Hh信號(hào)通路調(diào)節(jié)BIRC3基因轉(zhuǎn)錄效果。2.研究Hh信號(hào)通路轉(zhuǎn)錄因子Gli1與BIRC3啟動(dòng)子可能結(jié)合位點(diǎn),明確Gli1調(diào)節(jié)BIRC3基因轉(zhuǎn)錄具體機(jī)制。3.研究Gli1-依賴性BIRC3通路不同情況下胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡情況,探討Gli1-依賴的BIRC3與胰腺癌細(xì)胞生存之間的關(guān)系。研究方法:1.構(gòu)建SHh過表達(dá)/Gli1-shRNA干擾慢病毒載體,轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞AsPC-1、BxPC3,Panc-1,熒光定量PCR檢測(cè)Hh通路中SHh過表達(dá)和Gli1干擾時(shí)各胰腺癌細(xì)胞中SHh、Gli1以及BIRC3mRNA的表達(dá)。2.從真核生物啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫尋找并下載人源BIRC3啟動(dòng)子序列,生物信息學(xué)方法分析Gli1增強(qiáng)子與BIRC3啟動(dòng)子區(qū)可能結(jié)合位點(diǎn),SHh過表達(dá)/Gli1-shRNA干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞As PC-1,染色質(zhì)免疫共沉淀(XChIP-PCR)和雙熒光素酶基因報(bào)告分析Gli1與BIRC3基因結(jié)合具體位點(diǎn)。3.胰腺癌細(xì)胞AsPC-1,分別經(jīng)SHh過表達(dá)/Gli1-shRNA干擾/si BIRC3后,熒光定量PCR檢測(cè)SHh、Gli1、BIRC3及PNCAmRNA變化,western blot檢測(cè)SHh、Gli1、BIRC3及PNCA蛋白變化;MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力變化,Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,并進(jìn)行各組細(xì)胞caspase-3活性檢測(cè)。研究結(jié)果1.三種胰腺癌細(xì)胞中,SHh過表達(dá)時(shí),SHh、Gli1、BIRC3mRNA水平同步升高,Gli1干擾時(shí)SHhmRNA無明顯升高,隨Gli1mRNA表達(dá)下降,BIRC3mRNA水平同步下降,說明BIRC3mRNA水平與SHh-Gli1信號(hào)途徑活化呈正相關(guān)。2.生物信息學(xué)分析顯示BIRC3啟動(dòng)子區(qū)有3個(gè)位點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)Gli1增強(qiáng)子序列“GACCACCCA”配對(duì)率達(dá)89%,染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示Gli1抗體能富集BIRC3啟動(dòng)子,提示Gli1與BIRC3啟動(dòng)子在細(xì)胞內(nèi)存在特異性結(jié)合;SHh過表達(dá)時(shí)熒光素酶活性隨Gli1基因表達(dá)增加而升高,Gli1干擾時(shí)各位點(diǎn)熒光素酶活力無顯著變化,而SHh過表達(dá)位點(diǎn)2和3則熒光素酶活力存在明顯升高提示位點(diǎn)2和位點(diǎn)3是Gli1與BIRC3啟動(dòng)子區(qū)的可能結(jié)合位點(diǎn)。3.5組胰腺癌As PC-1細(xì)胞經(jīng)熒光定量PCR及western blotting檢測(cè)顯示,隨SHh/Gli1mRNA及蛋白表達(dá)增加,BIRC3、PCNA的mRAN及蛋白水平顯著增加,敲除BIRC3這種趨勢(shì)顯著逆轉(zhuǎn);MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,SHh過表達(dá)后細(xì)胞增殖增強(qiáng),Gli1干擾后細(xì)胞增殖減弱;si BIRC3后顯著逆轉(zhuǎn)SHh過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示,Gli1干擾后細(xì)胞凋亡率顯著增加,SHh過表達(dá)細(xì)胞凋亡率變化不明顯,siBIRC3后細(xì)胞凋亡率顯著增加;caspase-3活性檢測(cè)結(jié)果顯示,Gli1干擾后caspase-3活性明顯增加;SHh過表達(dá)后caspase-3活性降低,siBIRC3后caspase-3活性則明顯升高。研究結(jié)論1.Gli1通過順式作用元件促進(jìn)BIRC3轉(zhuǎn)錄。2.SHh-Gli1信號(hào)途徑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生存部分通過這種Gli1依賴性BIRC3模式實(shí)現(xiàn)的。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2423137