【摘要】：歐李(Cerasus humilis (Bge) Sok)和郁李(Cerasus japonica (Thunb.))同屬薔薇科櫻桃屬的落葉小灌木果樹,樹形極其相似但果實有機酸含量差異較大。本文通過研究歐李及郁李果實有機酸積累、蘋果酸代謝酶活性及其基因表達的差異,分析歐李和郁李果實中的有機酸代謝不同的原因。本文利用酸堿滴定法測定了歐李及郁李果實中可滴定酸的含量,用高效液相色譜法(HPLC)測定了蘋果酸和檸檬酸的含量。測定了果實發(fā)育過程中歐李及郁李NAD-MDH、PEPC、NADP-ME酶活性的變化。采用同源克隆法從郁李果實中克隆了NAD-MDH、NADP-ME、PEPC、VHA基因的保守區(qū)序列,并分析了歐李及郁李果實發(fā)育過程中NAD-MDH、NADP-ME、PEPC、VHA基因的表達情況。主要結(jié)果如下：(1)歐李果實中可滴定酸、蘋果酸和檸檬酸的變化趨勢一致：果實發(fā)育前期,有機酸的含量不斷增加,成熟前期迅速增加,成熟后有所下降。郁李果實中可滴定酸、蘋果酸和檸檬酸的變化趨勢基本一致：除接近成熟時蘋果酸略有增加外,整個發(fā)育過程中的有機酸含量一直在降低。歐李和郁李果實中所含的有機酸最多的是蘋果酸,其次是檸檬酸。成熟果實中,歐李的蘋果酸含量和檸檬酸含量分別占總酸含量的85.34%、10.98%,郁李的蘋果酸含量和檸檬酸含量分別占總酸含量的88.90%、4.74%。(2)NAD-MDH、PEPC和NADP-ME是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。NAD-MDH和PEPC主要促進了蘋果酸的合成,兩個酶的活性與歐李及郁李果實中蘋果酸的含量都呈極顯著正相關(guān),但是歐李及郁李中PEPC酶活性與蘋果酸含量的相關(guān)系數(shù)均低于NAD-MDH。NADP-ME的主要作用是促進蘋果酸的降解,其酶的活性與歐李及郁李果實中蘋果酸的含量都呈極顯著負相關(guān)。(3)克隆獲得郁李NAD-MDH、VHA、NADP-ME和PEPC四個基因的保守序列,長度分別為872bp、904bp、694bp、829bpo對克隆所得的各基因片段與其他近緣物種進行BLAST比對發(fā)現(xiàn)相似性都在90%以上。(4)熒光定量PCR結(jié)果表明,歐李和郁李果實中NAD-MDH、NADP-ME和PEPC基因的表達量變化趨勢除在果實發(fā)育初期各不相同外,硬核期后基因的表達量的變化趨勢基本相同。果實發(fā)育初期,郁李ME的基因表達量逐漸升高而歐李ME基因的表達量一直降低,使得兩種果實的有機酸含量變化趨勢不同。歐李VHA基因的表達量除在硬核期和膨大期略高于郁李外,其余發(fā)育時期都略低于郁李。在果實的整個發(fā)育過程中,促進蘋果酸合成的NAD-MDH、PEPC基因在歐李中的表達量要高于郁李,而促進蘋果酸降解的NADP-ME基因在歐李中的表達量低于郁李。但是各個基因的表達量和蘋果酸含量之間并不存在相關(guān)性。
[Abstract]:Oli (Cerasus humilis (Bge) Sok) and Yu Li (Cerasus japonica (Thunb.) The tree shape of deciduous small shrub fruit trees of the same genus of Rosaceae Cherry genus is very similar but the content of organic acid of fruit is quite different. In this paper, we studied the difference of organic acid accumulation, malate metabolic enzyme activity and gene expression in the fruit of Euclidean and Yu plum, and analyzed the reasons for the difference of organic acid metabolism in the fruit. The content of titratable acid in the fruit of Eucalyptus chinensis was determined by acid-base titration, and the contents of malic acid and citric acid were determined by (HPLC). The changes of NAD-MDH,PEPC,NADP-ME activity during fruit development were measured. The conserved region of NAD-MDH,NADP-ME,PEPC,VHA gene was cloned by homologous cloning method and the expression of NAD-MDH,NADP-ME,PEPC,VHA gene during fruit development was analyzed. The main results are as follows: (1) the change trend of titratable acid malic acid and citric acid in the fruit of Euchamnus chinensis is the same: the content of organic acid in the early stage of fruit development increases rapidly in the early stage of ripening and then decreases after ripening. The change trend of titratable acid malic acid and citric acid in the fruit was basically the same: the content of organic acid in the whole development process was decreasing except for the slight increase of malic acid in the fruit near maturation. Malic acid and citric acid are the most organic acids in the fruit. In mature fruit, malic acid content and citric acid content accounted for 85.34% of total acid content, and malic acid content and citric acid content accounted for 88.90% of total acid content. (2) NAD-MDH,. PEPC and NADP-ME are the key enzymes of malic acid metabolism. NAD-MDH and PEPC mainly promote the synthesis of malic acid. However, the correlation coefficient between the activity of PEPC and malic acid content was lower than that of NAD-MDH.NADP-ME, and the main effect of NAD-MDH.NADP-ME was to promote the degradation of malic acid. The activity of the enzyme was negatively correlated with the malic acid content in the fruit. (3) the conserved sequences of NAD-MDH,VHA,NADP-ME and PEPC genes were obtained, the length of which were 872 BP, 904 BP, 694 BP, respectively. BLAST comparison of the cloned gene fragments with other related species by 829bpo showed that the similarity was more than 90%. (4) the results of fluorescence quantitative PCR showed that the NAD-MDH, in the fruit of Eulis and Eupatorium chinensis was similar to that of other relative species. The trend of expression of NADP-ME and PEPC genes was similar except in the early stage of fruit development, and the change trend of gene expression after hard nucleus stage was basically the same. In the early stage of fruit development, the expression of ME gene increased gradually, while the expression of ME gene decreased, which made the change trend of organic acid content in the two kinds of fruits different. The expression of VHA gene was slightly lower in the development period than that in the hard nucleus stage and the expansion stage, except in the hard nucleus stage and the expansion stage, and the expression level of the VHA gene was slightly lower than that in the Yu Li stage. During the whole development of fruit, the expression of NAD-MDH,PEPC gene which promoted malic acid synthesis was higher in European plum than that in Yu plum, while the expression of NADP-ME gene that promoted malic acid degradation was lower in European plum than that in European plum. However, there was no correlation between the amount of gene expression and malic acid content.
【學位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S662.5;S662.9

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