應(yīng)用piggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在釀酒酵母中進(jìn)行基因突變
發(fā)布時(shí)間：2021-03-04 02:19
PiggyBac(PB)轉(zhuǎn)座子是來(lái)源于粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的TTAA型轉(zhuǎn)座子。PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可作為一種插入型突變工具,應(yīng)用于多種真核細(xì)胞中。傳統(tǒng)突變方法包括紫外誘變和化學(xué)誘變等,其造成的突變位點(diǎn)隨機(jī),需要使用文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)�；匮a(bǔ)或者定位克隆,操作復(fù)雜并且耗時(shí)較長(zhǎng)。與傳統(tǒng)突變方法比較,PB轉(zhuǎn)座子插入型突變可利用轉(zhuǎn)座子上的通用序列通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)快速檢測(cè)突變基因。目前,PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)已被用于在哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲和裂殖酵母等物種中進(jìn)行基因突變。然而,并未有研究報(bào)道在釀酒酵母中使用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)進(jìn)行基因突變。本研究在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中構(gòu)建了一個(gè)基于PB轉(zhuǎn)座子的篩選系統(tǒng)用于進(jìn)行體內(nèi)突變。這個(gè)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由兩部分組成,分別是插入ADE2基因編碼框的3?PB-TEFp-HIS3-5?PB轉(zhuǎn)座子,以及由半乳糖啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的PB轉(zhuǎn)座酶(PBase)。通過(guò)在半乳糖培養(yǎng)基中誘導(dǎo)PBase表達(dá),PB轉(zhuǎn)座子可以從原始插入位點(diǎn)無(wú)痕移除并隨機(jī)再次插入新的基因位點(diǎn)。PB轉(zhuǎn)座子在轉(zhuǎn)座過(guò)程中保持單一拷貝數(shù),在單個(gè)細(xì)胞中只導(dǎo)致一個(gè)突變位點(diǎn),并可快速檢測(cè)該突變基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本研究所構(gòu)建的PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)可用于釀酒酵母中,通過(guò)插入突變實(shí)現(xiàn)基因篩選。為了檢驗(yàn)所構(gòu)建的PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)用于在酵母體內(nèi)進(jìn)行篩選的效率,本研究將此篩選系統(tǒng)用于篩選與高爾基體α-1,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶(Och1p)定位有關(guān)的基因。Och1p定位于順面高爾基體,它可以運(yùn)輸至反面高爾基體,之后再通過(guò)逆運(yùn)輸機(jī)制回到順面高爾基體。雖然已有研究探索與Och1p運(yùn)輸至順面高爾基體有關(guān)的機(jī)制,但關(guān)于Och1p定位的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。作者構(gòu)建了截短型Och1-Suc2融合蛋白,在蔗糖酶缺失(suc2Δ)的酵母菌株中表達(dá)這一融合蛋白,由于大量融合蛋白停留在高爾基內(nèi),該菌株在蔗糖平板上生長(zhǎng)緩慢。如果經(jīng)過(guò)突變導(dǎo)致Och1-Suc2融合蛋白被分泌到或定位到細(xì)胞表面,該突變菌株在蔗糖平板上可具有較快生長(zhǎng)速率。利用這一生長(zhǎng)缺陷以及PB轉(zhuǎn)座子篩選系統(tǒng),作者篩選得到在蔗糖平板上具有較快生長(zhǎng)速率的突變株M6。在M6突變株中PB轉(zhuǎn)座子插入SCY1基因啟動(dòng)子區(qū)域,該突變株中SCY1基因表達(dá)量約為親株的70%。研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)Scy1p導(dǎo)致截短型Och1p進(jìn)入液泡,使高爾基體中截短型Och1p蛋白量下降,同時(shí)影響蔗糖酶的糖基化及分泌。根據(jù)篩選結(jié)果及后續(xù)實(shí)驗(yàn)推測(cè)SCY1基因與Och1p定位相關(guān)。進(jìn)一步證明利用PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在釀酒酵母中進(jìn)行突變能有效篩選控制相應(yīng)表型的目的基因。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78
本文編號(hào)：2415550
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78
文章目錄
摘要
Abstract
第一章 緒論
1.1 釀酒酵母中基因突變方法概述
1.2 PiggyBac轉(zhuǎn)座子介紹
1.2.1 國(guó)內(nèi)外piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用進(jìn)展
1.2.2 PiggyBac轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)座原理
1.3 高爾基體 α-1,6 甘露糖基轉(zhuǎn)移酶（Och1p）簡(jiǎn)介
1.4 SCY1基因簡(jiǎn)介
1.5 本論文研究意義和主要內(nèi)容
1.5.1 本論文研究意義
1.5.2 本論文主要內(nèi)容
第二章 材料和方法
2.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1 菌株
2.1.2 質(zhì)粒
2.1.3 引物
2.1.4 本研究所用試劑
2.1.5 培養(yǎng)基、試劑配制
2.1.6 主要設(shè)備
2.2 實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1 感受態(tài)細(xì)胞制備
2.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建
2.2.3 質(zhì)粒定點(diǎn)突變
2.2.4 質(zhì)粒一步轉(zhuǎn)化
2.2.5 線性轉(zhuǎn)化敲基因
2.2.6 點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)
2.2.7 釀酒酵母膜蛋白提取
2.2.8 TCA沉淀蛋白
2.2.9 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）
2.2.10 熒光定位
2.2.11 生長(zhǎng)曲線測(cè)定
2.2.12 PB轉(zhuǎn)座子移除率和再插入率計(jì)算方法
2.2.13 PB轉(zhuǎn)座子篩選方法
2.2.14 從突變株移除PB轉(zhuǎn)座子
2.2.15 巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證單個(gè)突變株中PB插入位點(diǎn)
2.2.16 下代測(cè)序法驗(yàn)證PB插入位點(diǎn)
2.2.17 Southern印跡雜交（Southern blot）
2.2.18 熒光定量PCR
第三章 結(jié)果與討論
3.1 釀酒酵母菌株中PB轉(zhuǎn)座子篩選系統(tǒng)的構(gòu)建
3.1.1 PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)座原理
3.1.2 轉(zhuǎn)座系統(tǒng)中PB移除率和再插入率
3.1.3 轉(zhuǎn)座過(guò)程中PB轉(zhuǎn)座子拷貝數(shù)的檢測(cè)
3.1.4 下代測(cè)序技術(shù)分析PB插入位點(diǎn)
3.2 截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白以及蔗糖酶分泌系統(tǒng)的構(gòu)建
3.2.1 截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白結(jié)構(gòu)
3.2.2 截短型Och1p仍定位于順面高爾基體
3.2.3 應(yīng)用蔗糖酶分泌系統(tǒng)對(duì)突變菌株進(jìn)行篩選
3.3 SCY1基因影響Och1p定位
3.3.1 PB篩選得到SCY1基因
3.3.2 過(guò)量表達(dá)SCY1基因使高爾基體中截短型Och1p蛋白量下降
3.3.3 過(guò)量表達(dá)SCY1基因?qū)е抡崽敲柑腔毕菁胺置诹繙p少
3.3.4 過(guò)量表達(dá)SCY1基因使截短型Och1-Suc2-Flag融合蛋白進(jìn)入液泡
主要結(jié)論與展望
主要結(jié)論
展望
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄：作者在碩士期間發(fā)表的論文
【參考文獻(xiàn)】
中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條
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本文編號(hào)：2415550
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