【摘要】：刺萼龍葵是原產(chǎn)北美的有毒有害入侵雜草,由于其適應(yīng)性廣、競爭能力強(qiáng)等特點(diǎn)在我國許多地區(qū)擴(kuò)散定植,嚴(yán)重破壞了入侵地的生物多樣性。種子是雜草發(fā)生危害和傳播擴(kuò)散的根源,刺萼龍葵種子具有休眠特性,不利于種群的集中防控和徹底根除。為了探究刺萼龍葵種子休眠萌發(fā)的分子調(diào)控機(jī)制,本研究針對種子萌發(fā)過程中降解胚乳組織的關(guān)鍵酶——甘露聚糖酶,克隆了甘露聚糖酶家族的2個基因SrMAN1和SrMAN2,在轉(zhuǎn)錄水平上檢測了外源激素作用下種子在浸種和萌發(fā)過程中的基因表達(dá)變化,進(jìn)行了目的基因的原核表達(dá),并采用凝膠擴(kuò)散法驗證了重組蛋白的功能。主要研究結(jié)果如下:1.從刺萼龍葵中克隆得到兩個β-甘露聚糖酶相關(guān)基因,其中SrMAN1基因全長1921 bp,SrMAN2基因全長3075 bp。SrMAN1基因的編碼序列為1143 bp,編碼380個氨基酸,蛋白分子量為42.9 kD,等電點(diǎn)為5.4。SrMAN2基因的編碼序列為1242 bp,編碼413個氨基酸,蛋白分子量為46.6 kD,等電點(diǎn)為5.2。2.實時熒光定量PCR分析表明,赤霉素處理下,SrMAN1和SrMAN2基因均在胚根伸長約10 mm,胚軸露出約2 mm時達(dá)到表達(dá)高峰。隨著種子吸水時間的延長,脫落酸作用下兩個基因的相對表達(dá)量較低;而在赤霉素與清水處理下,兩個基因的表達(dá)量先升高再降低,并且赤霉素使兩個基因的表達(dá)高峰提前出現(xiàn);赤霉素處理下,SrMAN1基因的表達(dá)高峰高于清水處理下的表達(dá)高峰,SrMAN2基因的表達(dá)高峰低于清水處理下的表達(dá)高峰。SrMAN1和SrMAN2基因在刺萼龍葵種子萌發(fā)前后均有表達(dá),其表達(dá)無顯著的組織特異性和時間特異性。赤霉素可在一定程度上影響SrMAN1和SrMAN2基因的表達(dá),但相比于SrMAN1基因,赤霉素對SrMAN2基因的作用較弱。3.成功構(gòu)建了SrMAN1和SrMAN2基因的重組表達(dá)載體pET-32a-SrMAN1和pET-32a-SrMAN2,實現(xiàn)了在E.coli BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)。菌液SDS-PAGE表明,SrMAN1、SrMAN2的標(biāo)簽融合蛋白的出現(xiàn)位置與預(yù)測的SrMAN1融合蛋白(62.78 kD)、SrMAN2融合蛋白(66.37 kD)大小接近。凝膠擴(kuò)散檢測表明,成功表達(dá)的菌株孵育液在甘露聚糖凝膠底物上出現(xiàn)顯著增大的水解圈,證實了融合蛋白具有甘露聚糖酶水解活力。
[Abstract]:Solanum nigrum is a poisonous and harmful weed native to North America. Because of its wide adaptability and strong competitive ability, it has spread and settled in many areas of China, which has seriously damaged the biodiversity of the invading land. Seed is the root of weed damage and spread. The seed of Solanum nigrum has dormancy characteristics, which is not conducive to the centralized control and eradication of the population. In order to explore the molecular regulation mechanism of dormancy germination of Solanum nigrum seeds, two genes of mannanase family, SrMAN1 and SrMAN2, were cloned for the key enzyme of degradation of endosperm tissue during seed germination. The changes of gene expression during seed soaking and germination were detected at the transcriptional level, the prokaryotic expression of the target gene was carried out, and the function of the recombinant protein was verified by gel diffusion method. The main results are as follows: 1. Two 尾 -mannanase related genes were cloned from Solanum nigrum. The coding sequence of 3075 bp.SrMAN1 gene of 1921 bp,SrMAN2 gene of SrMAN1 gene was 1143 bp, encoding 380 amino acids and the molecular weight of protein was 42.9 kD,. The coding sequence of 5.4.SrMAN2 gene with isoelectric point is 1242 bp, encoding 413 amino acids and the molecular weight of protein is 46.6 kD, isoelectric point 5.2.2. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression of SrMAN1 and SrMAN2 genes reached the peak when the radicle elongation was about 10 mm, and the cotyledon was exposed to about 2 mm under gibberellin treatment. With the prolongation of water absorption time, the relative expression of the two genes was lower under the action of abscisic acid. Under the treatment of gibberellin and water, the expression of the two genes increased first and then decreased, and gibberellin made the expression peak of the two genes appear earlier. Under gibberellin treatment, the peak of SrMAN1 gene expression was higher than that of water treatment, and the peak of SrMAN2 gene expression was lower than that of clear water treatment. Both SrMAN1 and SrMAN2 genes were expressed before and after germination of Solanum nigrum seeds. There was no significant tissue specificity and time specificity. Gibberellin could affect the expression of SrMAN1 and SrMAN2 genes to some extent, but the effect of gibberellin on SrMAN2 gene was weaker than that of SrMAN1 gene. The recombinant expression vectors of SrMAN1 and SrMAN2 genes pET-32a-SrMAN1 and pET-32a-SrMAN2, were successfully constructed to induce expression in E.coli BL21 (DE3). SDS-PAGE showed that the location of the SrMAN1,SrMAN2 fusion protein was similar to that of the predicted SrMAN1 fusion protein (62.78 kD), SrMAN2 fusion protein (66.37 kD). The gel diffusion test showed that the successfully expressed strain incubated on the gel substrate of mannan showed a significantly increased hydrolysis circle, which confirmed that the fusion protein had the activity of hydrolysis of mannanase.
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S451

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王彩鳳;洪源;孫亮;;關(guān)于白城發(fā)生的刺萼龍葵的生物學(xué)特性和防治方法分析[J];吉林農(nóng)業(yè);2010年11期

2 梁維敏;田春雨;;刺萼龍葵的識別與綜合防控[J];天津科技;2011年01期

3 梁維敏;田春雨;王緹;;刺萼龍葵的識別與防控[J];園藝與種苗;2011年02期

4 劉寧;劉玉升;付衛(wèi)東;張國良;;外來刺萼龍葵與本地龍葵的比較[J];雜草科學(xué);2011年03期

5 孟娟;;刺萼龍葵的危害與防治[J];吉林蔬菜;2012年02期

6 卡哈爾·哈力克;李家春;;托克遜刺萼龍葵發(fā)生特點(diǎn)及防治對策[J];農(nóng)村科技;2013年11期

7 王維升,鄭紅旗,朱殿敏,姜宗輝,王宇飛;有害雜草刺萼龍葵的調(diào)查[J];植物檢疫;2005年04期

8 高芳,徐馳,周云龍;外來植物刺萼龍葵潛在危險性評估及其防治對策[J];北京師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2005年04期

9 高芳,徐馳;潛在危險性外來物種——刺萼龍葵[J];生物學(xué)通報;2005年09期

10 魏守輝;張朝賢;劉延;黃紅娟;孟慶會;崔海蘭;李香菊;;外來雜草刺萼龍葵及其風(fēng)險評估[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2007年03期

相關(guān)會議論文 前4條

1 祝明煒;楊紅;陳旭輝;曲波;;刺萼龍葵入侵對土壤酶及真菌多樣性的影響[A];第三屆全國生物入侵大會論文摘要集——“全球變化與生物入侵”[C];2010年

2 王承旭;曲波;陳旭輝;祝明煒;翟強(qiáng);;刺萼龍葵種子萌發(fā)抑制物質(zhì)的生物測定[A];第三屆全國生物入侵大會論文摘要集——“全球變化與生物入侵”[C];2010年

3 冷梅;高拓新;;檢疫對象植物刺萼龍葵在朝陽地區(qū)的發(fā)生與防治[A];遼寧省農(nóng)林業(yè)無害化生產(chǎn)技術(shù)研討會論文集[C];2011年

4 曲波;王承旭;陳旭輝;翟強(qiáng);;刺萼龍葵種子提取物對白菜種子及幼苗化感作用的研究[A];第三屆全國生物入侵大會論文摘要集——“全球變化與生物入侵”[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 記者 劉利民;采取有力措施鏟除刺萼龍葵[N];朝陽日報;2008年

2 記者 劉利民;各地緊急行動鏟除刺萼龍葵[N];朝陽日報;2009年

3 姜毅　文禾;我市打響鏟除刺萼龍葵戰(zhàn)役[N];朝陽日報;2010年

4 周里;朝陽開展鏟除毒草刺萼龍葵行動[N];遼寧日報;2008年

5 齊海山;從刺萼龍葵治理看我國外來入侵物種的防治與管理[N];東方城鄉(xiāng)報;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 張少逸;北京地區(qū)刺萼龍葵發(fā)生動態(tài)及化學(xué)防控研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 王旭;刺萼龍葵種子萌發(fā)相關(guān)的甘露聚糖酶基因的克隆及表達(dá)研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

3 邢慶新;刺萼龍葵次生代謝產(chǎn)物的殺蟲活性研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 楊龍;外來入侵雜草刺萼龍葵種子萌發(fā)機(jī)制[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

，

本文編號：2414458