【摘要】：青蒿素(Artemisinin)是從藥用植物黃花蒿(Artemisia annua L.)中提取的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯,其過氧橋結(jié)構(gòu)對于青蒿素抗瘧活性至關(guān)重要。青蒿素具有在血液中溶解性好、效率高、毒性小等優(yōu)點,成為治療瘧疾的首選藥物,特別是對于抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧效果極佳。因此,世界衛(wèi)生組織(Word Health Organization,WHO)推薦使用以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(Artemisinin Combination Therapies,ATCs)治療瘧疾。在天然的黃花蒿中,青蒿素含量較低,大約僅占干重的0.01%~0.8%。除此之外,由于青蒿素的全化學合成得路線復雜、成本高、產(chǎn)率低和毒性大等諸多因素,導致青蒿素生產(chǎn)成本較高,很難實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此,提高青蒿素的產(chǎn)量、降低青蒿素藥物成本對緩解青蒿素的市場需求是十分必要。近年來,隨著青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的研究,利用遺傳工程改造青蒿素生物合成途徑已成為提高青蒿素含量的有效手段之一。羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶(Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl4-diphosphate reductase,HDR)是MEP途徑中最后一個酶,催化羥甲基丁烯基-4-磷酸(HMBPP)生成異戊烯基焦磷酸(IPP)和IPP的同分異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是萜類物質(zhì)(包括青蒿素)生物合成的前體物質(zhì)。本文根據(jù)AaHDR2基因EST(Contig19910)序列信息,采用RACE技術(shù),從黃花蒿中克隆了AaHDR2基因(登錄號:KX058541),并對其所編碼的氨基酸序列進行了分析,結(jié)果與已報道的AaHDR1氨基酸序列同源性為81.8%;與其他植物HDRs氨基酸序列也具有較高同源性:如與艾菊HDR同源性為84.6%;與葡萄HDR同源性為78.5%。AaHDR2與已經(jīng)報道的黃花蒿HDR1及其他植物HDRs在氨基酸序列上較高同源性表明該基因確實是黃花蒿HDR,屬于HDR家族。并進一步采用功能互補在E.coli突變體MG1655araHDR中證明AaHDR2編碼蛋白質(zhì)具有HDR的催化功能。其基因表達分析的結(jié)果表明:AaHDR2在黃花蒿分泌型腺毛體中表達量遠高于在根、莖、葉和花中的表達量;MeJA、ABA和GA3都能夠大幅度上調(diào)AaHDR2的表達。并且亞細胞定位結(jié)果顯示:AaHDR2融合GFP特異性定位于葉綠體中,符合MEP途徑定位于質(zhì)體的事實。構(gòu)建含有AaHDR2的植物表達載體pHB-Aa HDR2,并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,獲得工程菌。用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,并收集擬南芥種子播種于含250mg.l-1頭孢霉素和50mg.l-1潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上進行篩選,將篩選得到的擬南芥移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中,在25℃、光周期為16 h光照、8 h黑暗的條件下生長2周,取其葉片進行基因組PCR檢測,包括:目的基因AaHDR2和抗性基因Hygr的檢測,用于進一步確認轉(zhuǎn)基因擬南芥,隨后測定轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。在過表達AaHDR2的擬南芥植株中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量與對照相比有顯著提高。對照擬南芥株系的葉綠素a含量為0.500±0.010mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個株系的葉綠素a含量分別為0.567±0.006mg/g、0.613±0.024mg/g、0.607±0.002mg/g,與對照相比分別提高了13.42%、22.58%、21.29%;對照擬南芥株系的葉綠素b含量為0.207±0.003mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個株系的葉綠素b含量分別為0.222±0.007mg/g、0.239±0.002mg/g、0.235±0.004mg/g與對照相比分別提高了7.10%、15.16%、13.50%;對照擬南芥株系的類胡蘿卜素含量為0.095±0.002mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個株系的類胡蘿卜素含量分別為0.109±0.002mg/g、0.116±0.002mg/g、0.120±0.001mg/g,與對照相比分別提高了14.92%、22.75%、27.42%。在擬南芥三個轉(zhuǎn)基因株系中雖然這三種產(chǎn)物含量提高的程度不同,但與對照相比都有顯著性提高,這可能是因為AaHDR2在擬南芥中過表達從而為以異戊二烯為基本單元合成的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的生物合成提供了更多的前體物質(zhì)。這表明AaHDR2的過表達對萜類物質(zhì)的合成具有重要作用,而且為后續(xù)在黃花蒿中過表達AaHDR2實驗提供了理論依據(jù)。綜上所述,本研究對AaHDR2克隆和功能分析有助于闡明青蒿素生物合成的分子調(diào)控機制,并為通過遺傳工程技術(shù)提高青蒿素次生代謝工程提供一個可能的候選靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 周英平;趙敏;周志強;;黃花蒿資源的研究進展[J];國土與自然資源研究;2006年03期

2 付曉萍;;西寧地區(qū)黃花蒿的生物學特性[J];青海大學學報(自然科學版);2007年04期

3 趙素云;孫西;;黃花蒿[J];植物雜志;1980年04期

4 劉群;楊智蘊;鄧治邦;沙國恒;王新甫;;黃花蒿花序精油化學成分初步分析[J];Journal of Integrative Plant Biology;1988年02期

5 劉群;楊智蘊;鄧治鄭;賈國祥;;黃花蒿精油研究[J];東北師大學報(自然科學版);1989年03期

6 韋霄,李鋒,許成瓊,傅秀紅,黃正福;黃花蒿生物學特性研究[J];廣西植物;1997年02期

7 李鋒,韋霄,許成瓊,傅秀紅,黃正福;廣西黃花蒿類型調(diào)查研究[J];廣西植物;1997年03期

8 許成瓊,韋霄,李鋒,傅秀紅;黃花蒿繁殖技術(shù)研究[J];廣西植物;1998年03期

9 林有潤,黃奏球;蘄州地區(qū)的蘄艾、青蒿、黃花蒿與茵陳的考訂[J];廣西植物;1983年01期

10 唐安茂;胡曉華;;酉陽黃花蒿資源多[J];植物雜志;1987年03期

相關(guān)會議論文 前8條

1 周國海;曹庸;徐東翔;雷勇;肖蘇堯;陳雪香;林健輝;李偉;;黃花蒿多倍體誘導初步研究[A];全國第8屆天然藥物資源學術(shù)研討會論文集[C];2008年

2 孫年喜;李隆云;崔廣林;;黃花蒿開花生物學研究[A];重慶市中醫(yī)藥學會2011年學術(shù)年會論文集[C];2011年

3 黃京華;譚鉅發(fā);揭紅科;曾任森;;接種叢枝菌根真菌對黃花蒿生長及其藥效成分的影響[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 仇惠君;曾富蘭;曾燕紅;劉要鑫;黃京華;黃榮韶;;AM真菌對黃花蒿養(yǎng)分吸收和有效成分積累的效應[A];生態(tài)文明建設(shè)中的植物學：現(xiàn)在與未來——中國植物學會第十五屆會員代表大會暨八十周年學術(shù)年會論文集——第2分會場：植物生態(tài)與環(huán)境保護[C];2013年

5 鄧啟迪;張曉蓉;唐莉;徐定華;李杰;;基于TLC斑點面積法定量分析不同生長期黃花蒿青蒿酸含量[A];生態(tài)文明建設(shè)中的植物學：現(xiàn)在與未來——中國植物學會第十五屆會員代表大會暨八十周年學術(shù)年會論文集——第4分會場：資源植物學[C];2013年

6 王麗芳;盧德勛;高民;;研究添加黃花蒿乙醇提取物對奶山羊體外發(fā)酵指標和CLA及trans11-C_(18:1)含量的影響[A];第六次全國飼料營養(yǎng)學術(shù)研討會論文集[C];2010年

7 張鳳杰;陳功錫;劉祝祥;;湘西產(chǎn)黃花蒿揮發(fā)性成分分析[A];第九屆全國藥用植物及植物藥學術(shù)研討會論文集[C];2010年

8 熊利芝;李子唯;張曉蓉;歐陽文;李貴;李娜;;超聲醇提黃花蒿殘渣總黃酮的工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[A];生態(tài)文明建設(shè)中的植物學：現(xiàn)在與未來——中國植物學會第十五屆會員代表大會暨八十周年學術(shù)年會論文集——第4分會場：資源植物學[C];2013年

相關(guān)重要報紙文章 前2條

1 毛國寅;恩施州黃花蒿開發(fā)初露端倪[N];中國醫(yī)藥報;2005年

2 記者 陳云芬;良種良法加速云藥資源開發(fā)利用[N];云南日報;2009年

相關(guān)博士學位論文 前5條

1 吳葉寬;黃花蒿化感作用與友好栽培研究[D];西南大學;2013年

2 李潔;黃花蒿內(nèi)生放線菌資源及其對黃花蒿生長和青蒿素生物合成的影響[D];云南大學;2010年

3 李弘劍;黃花蒿細胞培養(yǎng)過程中細胞生長及青蒿素生物合成的調(diào)節(jié)控制[D];華南理工大學;1994年

4 李倩;黃花蒿對土壤微生物的化感效應[D];西南大學;2015年

5 張永強;黃花蒿殺螨物質(zhì)活性追蹤及殺螨作用機理研究[D];西南大學;2008年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 賈雪婷;黃花蒿對列當種子萌發(fā)的誘導作用初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2016年

2 王煥燕;黃花蒿ALDH1啟動子的克隆及其功能分析[D];西南大學;2016年

3 王聰慧;黃花嵩轉(zhuǎn)錄因子AaWD40的克隆及DXR基因的RNA干擾研究[D];蘇州大學;2016年

4 曹芳;黃花蒿HDR基因克隆及功能研究[D];西南大學;2016年

5 夏倩華;內(nèi)生鏈霉菌（Streptomyces sp.）對黃花蒿生長和青蒿素合成的影響[D];蘇州大學;2016年

6 熊碩;黃花蒿中黃酮類化合物生物合成AaF3H和AaFLS基因克隆與功能鑒定[D];湖南農(nóng)業(yè)大學;2015年

7 馬源;叢枝菌根真菌對黃花蒿根圍土壤的影響[D];廣西大學;2016年

8 吳潔敏;水楊酸對黃花蒿生長及青蒿素積累的影響研究[D];廣西大學;2016年

9 趙紅梅;黃花蒿（Artemisia annua.L）化感物質(zhì)的釋放途徑及其主要化感物質(zhì)的分離鑒定[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學;2008年

10 李承卓;黃花蒿種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[D];廣西大學;2013年

，

本文編號：2410197