【摘要】：青蒿素(Artemisinin)是從藥用植物黃花蒿(Artemisia annua L.)中提取的一種含有過氧橋結(jié)構(gòu)的新型倍半萜內(nèi)酯,其過氧橋結(jié)構(gòu)對(duì)于青蒿素抗瘧活性至關(guān)重要。青蒿素具有在血液中溶解性好、效率高、毒性小等優(yōu)點(diǎn),成為治療瘧疾的首選藥物,特別是對(duì)于抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧效果極佳。因此,世界衛(wèi)生組織(Word Health Organization,WHO)推薦使用以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法(Artemisinin Combination Therapies,ATCs)治療瘧疾。在天然的黃花蒿中,青蒿素含量較低,大約僅占干重的0.01%~0.8%。除此之外,由于青蒿素的全化學(xué)合成得路線復(fù)雜、成本高、產(chǎn)率低和毒性大等諸多因素,導(dǎo)致青蒿素生產(chǎn)成本較高,很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此,提高青蒿素的產(chǎn)量、降低青蒿素藥物成本對(duì)緩解青蒿素的市場(chǎng)需求是十分必要。近年來,隨著青蒿素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的研究,利用遺傳工程改造青蒿素生物合成途徑已成為提高青蒿素含量的有效手段之一。羥甲基丁烯基-4-磷酸還原酶(Hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl4-diphosphate reductase,HDR)是MEP途徑中最后一個(gè)酶,催化羥甲基丁烯基-4-磷酸(HMBPP)生成異戊烯基焦磷酸(IPP)和IPP的同分異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。IPP和DMAPP是萜類物質(zhì)(包括青蒿素)生物合成的前體物質(zhì)。本文根據(jù)AaHDR2基因EST(Contig19910)序列信息,采用RACE技術(shù),從黃花蒿中克隆了AaHDR2基因(登錄號(hào):KX058541),并對(duì)其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析,結(jié)果與已報(bào)道的AaHDR1氨基酸序列同源性為81.8%;與其他植物HDRs氨基酸序列也具有較高同源性:如與艾菊HDR同源性為84.6%;與葡萄HDR同源性為78.5%。AaHDR2與已經(jīng)報(bào)道的黃花蒿HDR1及其他植物HDRs在氨基酸序列上較高同源性表明該基因確實(shí)是黃花蒿HDR,屬于HDR家族。并進(jìn)一步采用功能互補(bǔ)在E.coli突變體MG1655araHDR中證明AaHDR2編碼蛋白質(zhì)具有HDR的催化功能。其基因表達(dá)分析的結(jié)果表明:AaHDR2在黃花蒿分泌型腺毛體中表達(dá)量遠(yuǎn)高于在根、莖、葉和花中的表達(dá)量;MeJA、ABA和GA3都能夠大幅度上調(diào)AaHDR2的表達(dá)。并且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示:AaHDR2融合GFP特異性定位于葉綠體中,符合MEP途徑定位于質(zhì)體的事實(shí)。構(gòu)建含有AaHDR2的植物表達(dá)載體pHB-Aa HDR2,并將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中,獲得工程菌。用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,并收集擬南芥種子播種于含250mg.l-1頭孢霉素和50mg.l-1潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,將篩選得到的擬南芥移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中,在25℃、光周期為16 h光照、8 h黑暗的條件下生長(zhǎng)2周,取其葉片進(jìn)行基因組PCR檢測(cè),包括:目的基因AaHDR2和抗性基因Hygr的檢測(cè),用于進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因擬南芥,隨后測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量。在過表達(dá)AaHDR2的擬南芥植株中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的含量與對(duì)照相比有顯著提高。對(duì)照擬南芥株系的葉綠素a含量為0.500±0.010mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素a含量分別為0.567±0.006mg/g、0.613±0.024mg/g、0.607±0.002mg/g,與對(duì)照相比分別提高了13.42%、22.58%、21.29%;對(duì)照擬南芥株系的葉綠素b含量為0.207±0.003mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個(gè)株系的葉綠素b含量分別為0.222±0.007mg/g、0.239±0.002mg/g、0.235±0.004mg/g與對(duì)照相比分別提高了7.10%、15.16%、13.50%;對(duì)照擬南芥株系的類胡蘿卜素含量為0.095±0.002mg/g,轉(zhuǎn)基因擬南芥三個(gè)株系的類胡蘿卜素含量分別為0.109±0.002mg/g、0.116±0.002mg/g、0.120±0.001mg/g,與對(duì)照相比分別提高了14.92%、22.75%、27.42%。在擬南芥三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中雖然這三種產(chǎn)物含量提高的程度不同,但與對(duì)照相比都有顯著性提高,這可能是因?yàn)锳aHDR2在擬南芥中過表達(dá)從而為以異戊二烯為基本單元合成的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的生物合成提供了更多的前體物質(zhì)。這表明AaHDR2的過表達(dá)對(duì)萜類物質(zhì)的合成具有重要作用,而且為后續(xù)在黃花蒿中過表達(dá)AaHDR2實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。綜上所述,本研究對(duì)AaHDR2克隆和功能分析有助于闡明青蒿素生物合成的分子調(diào)控機(jī)制,并為通過遺傳工程技術(shù)提高青蒿素次生代謝工程提供一個(gè)可能的候選靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：2410197