【摘要】：黏膜免疫作為免疫的第一道防線,能夠起到識別和中和病原,誘導(dǎo)免疫細(xì)胞吞噬病原等重要作用。多聚免疫球蛋白受體pIgR(polymeric immunoglobulin receptor)是脊椎動物黏膜免疫中的重要分子,在魚類免疫中發(fā)揮重要作用。草魚(Ctenopharyngodon idellus)作為重要的經(jīng)濟(jì)魚類,易受病原侵襲而患病。免疫是防控疾病發(fā)生的有效方法,但對魚類免疫的分子機(jī)制仍不夠清楚。本文通過研究pIgR基因克隆、表達(dá)分析及與IgM的結(jié)合活性,旨在為提高草魚免疫防控水平提供理論依據(jù)。本研究采用RT-PCR、3’-RACE和5’-RACE技術(shù)方法擴(kuò)增得到草魚pIgR的cDNA序列,通過序列拼接,獲得pIgR全長序列,草魚pIgR全長1667 bp,含有一個1008 bp的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。編碼336個氨基酸,5’非編碼區(qū)長度為77 bp,3’非編碼區(qū)長度為579 bp。草魚pIgR蛋白由胞外段、跨膜段、胞內(nèi)段三部分組成,推測分子量為37.22kDa,前端由22個氨基酸組成信號肽,胞外段包括有兩個ILD結(jié)構(gòu)域。采用RT-qPCR方法,研究草魚皮膚、肌肉、鰓、肝臟、脾臟、腸、頭腎和心臟中pIgR mRNA水平表達(dá)差異,結(jié)果顯示腸中pIgR mRNA表達(dá)水平最高,其次是脾臟,肝臟、頭腎和肌肉中表達(dá)量較少。采用原核表達(dá)載體pET-32a,表達(dá)草魚pIgR蛋白;利用Rosetta大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),大量誘導(dǎo)表達(dá)重組pIgR蛋白。純化重組表達(dá)的pIgR蛋白,將其免疫小鼠制備其特異性抗體。構(gòu)建pcDNA3.1-pIgR真核表達(dá)載體,然后轉(zhuǎn)染至草魚卵巢細(xì)胞系GCO(Grass carp ovary)中,使用本研究制備的鼠抗草魚pIgR抗體作為一抗,FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗,利用免疫熒光法檢測到草魚pIgR蛋白表達(dá)。并使用草魚天然IgM以及兔抗草魚IgM的抗體,在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-pIgR的細(xì)胞中檢測到pIgR和IgM的結(jié)合。
[Abstract]:As the first line of defense, mucosal immunity can recognize and neutralize the pathogen and induce immune cells to phagocytosis. Polyimmunoglobulin receptor (pIgR (polymeric immunoglobulin receptor) is an important molecule in vertebrate mucosal immunity and plays an important role in fish immunity. As an important economic fish, grass carp (Ctenopharyngodon idellus) is susceptible to pathogens. Immunization is an effective method to prevent and control diseases, but the molecular mechanism of fish immunity is still unclear. In this paper, the cloning, expression analysis and binding activity of pIgR gene with IgM were studied in order to provide theoretical basis for improving the immune control level of grass carp. In this study, the cDNA sequence of grass carp pIgR was amplified by RT-PCR,3'-RACE and 5'-RACE techniques. The full-length pIgR sequence was obtained by sequence splicing. The full-length pIgR 1667 bp, contained an open reading frame (Open reading frame,ORF (1008 bp). Encoding 336 amino acids, 5 'non-coding region is 77 bp,3', non-coding region is 579 bp.. The pIgR protein of grass carp is composed of three parts: extracellular, transmembrane and intracellular, and its molecular weight is 37. 22 kDa. The front end consists of 22 amino acids, and the extracellular domain consists of two ILD domains. The expression of pIgR mRNA in skin, muscle, Gill, liver, spleen, intestine, head kidney and heart of grass carp was studied by RT-qPCR. The results showed that the expression of pIgR mRNA in intestine was the highest, followed by spleen and liver. There is less expression in head kidney and muscle. The prokaryotic expression vector pET-32a, was used to express the pIgR protein of grass carp and the recombinant pIgR protein was expressed in large quantities by using the Rosetta Escherichia coli expression system. The recombinant pIgR protein was purified and immunized to prepare its specific antibody. The eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-pIgR was constructed and transfected into grass carp ovarian cell line GCO (Grass carp ovary). The mouse anti-grass carp pIgR antibody was used as the first antibody, and the FITC labeled goat anti-mouse antibody was used as the second antibody. The expression of pIgR protein in grass carp was detected by immunofluorescence. The binding of pIgR and IgM was detected in pcDNA3.1-pIgR transfected cells using natural grass carp IgM and rabbit antibody against grass carp IgM.
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：2391275