【摘要】：目的構(gòu)建有效針對(duì)小鼠C/EBP同源蛋白(CHOP)的shRNA真核表達(dá)載體,基因沉默后對(duì)Hepa 1-6細(xì)胞凋亡的影響。方法設(shè)計(jì)合成針對(duì)CHOP的shRNA靶序列及無(wú)同源性的shRNA序列作為陰性對(duì)照,退火后重組入p LKO.1-TRC載體,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后進(jìn)行快速雙酶切鑒定;慢病毒包裝法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得的病毒上清轉(zhuǎn)染Hepa 1-6細(xì)胞,用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基連續(xù)篩選10獲得穩(wěn)定株,Western blot檢測(cè)Caspase9和c-PARP蛋白表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果各shRNA載體構(gòu)建成功;與陰性對(duì)照組相比,sh CHOP組能顯著抑制CHOP蛋白的表達(dá)(P0.05);且CHOP基因沉默后明顯降低了衣霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P0.05)。結(jié)論 CHOP基因沉默能減緩衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生的Hepa 1-6細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Objective to construct an eukaryotic expression vector of shRNA targeting mouse C/EBP homologous protein (CHOP), and to investigate the effect of gene silencing on apoptosis of Hepa 1-6 cells. Methods shRNA target sequences for CHOP and shRNA sequences with no homology were designed and synthesized as negative control. After annealing, they were recombined into p LKO.1-TRC vector and identified by rapid double enzyme digestion after transformation and amplification. The virus supernatant of 293T cells transfected with lentivirus packaging was transfected into Hepa 1-6 cells. The stable strain, Western blot and c-PARP protein expression were detected by continuous screening of 10 culture medium containing purine mycin, and the cell cycle was detected by flow cytometry. Results the shRNA vectors were successfully constructed. Compared with the negative control group, sh CHOP could significantly inhibit the expression of CHOP protein (P0.05), and CHOP gene silencing significantly decreased the apoptosis induced by itamine (P0.05). Conclusion CHOP gene silencing can attenuate the apoptosis of Hepa 1-6 cells induced by endoplasmic reticulum stress.
【作者單位】： 福州總醫(yī)院福建省移植生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81270431)
【分類號(hào)】：R73-3

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本文編號(hào)：2387596