【摘要】：漆酶(Laccase,EC1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶,屬于藍(lán)色多銅氧化酶(MCOs)家族,其底物包括一大類酚類、非酚類化合物。漆酶的催化氧化過程包括奪取反應(yīng)底物的電子,活性中心的銅離子間的協(xié)同電子傳遞,最后將電子傳遞給O2使其還原為水。由于漆酶底物的廣泛性,使得漆酶在紡織工業(yè)、紙漿造紙、食品工業(yè)、生物傳感器等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。因此,獲得具有優(yōu)良特性和高活性的漆酶具有重要價(jià)值。而相比于真菌漆酶,細(xì)菌漆酶往往具有耐高溫、耐高堿和耐高鹽等優(yōu)勢(shì)。本論文通過基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘技術(shù)挖掘得到3個(gè)新細(xì)菌漆酶,分別命名為L(zhǎng)acTT、Lac CT和Lac BE,其中LacTT有較好的酶學(xué)特性。為了獲得LacTT的大量表達(dá),本論文選擇畢赤酵母對(duì)LacTT進(jìn)行過量分泌表達(dá),并對(duì)其酶特性及其對(duì)工業(yè)染料的脫色性能進(jìn)行研究。此外,通過同源建模和定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)LacTT的底物結(jié)合和電子傳遞的關(guān)鍵氨基酸及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)本研究通過基因組數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘技術(shù)從Gen Bank中挖掘得到3個(gè)未經(jīng)報(bào)道的新細(xì)菌漆酶,分別來源于Thermus thermophilus SG0.5JP17-16、Caldalkalibacillus thermarum TA2.A1和Bacillus endophyticus(LacTT、Lac CT和Lac BE)。通過對(duì)3個(gè)細(xì)菌漆酶的最適溫度和最適pH的研究發(fā)現(xiàn):LacTT具有最高的反應(yīng)溫度(90℃)和較寬的反應(yīng)pH,其在高溫、pH中性和堿性條件下具有較高酶活力;Lac BE則有較寬的反應(yīng)溫度和pH,但是它的最適pH偏酸性;而Lac CT盡管表現(xiàn)出最高的最適pH,但是它的反應(yīng)溫度和pH范圍都比較窄。而且,LacTT的純化結(jié)果表明它易于純化。LacTT的酶學(xué)特性研究表明它具有較高的應(yīng)用潛力。(2)本研究構(gòu)建了畢赤酵母重組漆酶LacTT高效表達(dá)體系,在搖瓶培養(yǎng)條件下,最大漆酶表達(dá)量達(dá)到709 U/L。重組LacTT的酶學(xué)特性分析表明:重組LacTT在中性和堿性條件下具有比較高的活力和穩(wěn)定性,而且具有高溫活性和很高的熱穩(wěn)定性,最適溫度高達(dá)90℃,在90℃下的半衰期約4 h。LacTT對(duì)鹵化物的耐受性超過其它大多數(shù)的漆酶,而且,在1 M濃度范圍內(nèi),NaCl和NaBr對(duì)LacTT的酶活力有不同程度的提高。重組LacTT對(duì)4種工業(yè)染料的脫色率介于73%-94%,而且,Na Cl可以提高LacTT的脫色效率。因此,LacTT在紡織染料廢水脫色方面具有較高的應(yīng)用潛力。(3)本研究基于序列比對(duì)、同源建模和定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)LacTT的底物結(jié)合域附近的三個(gè)極性帶電荷的氨基酸K428、R290和D394及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。同源建模結(jié)構(gòu)表明LacTT具有酶蛋白空間結(jié)構(gòu)和活性中心結(jié)構(gòu)的保守性。K428、R290和D394的突變體在600 nm和330 nm處的特征吸收峰較野生型有所差異,說明突變位點(diǎn)對(duì)LacTT的銅中心位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)都有一定擾動(dòng)。K428M酶活力較野生型LacTT有所提高,而R290A、R290H、D394A、D394R的酶活力較野生型有所降低,表明:K428、R290和D394對(duì)LacTT的酶催化活性有顯著的影響。K428M的k_(cat)/K_m值約為野生型的2倍,K_m值約為野生型的1/2,表明K428M酶催化效率的提高是因?yàn)橥蛔凅w與底物的親和力增大。突變體R290A和R290H的酶活力較野生型有所降低,D394A和D394R酶活力也幾乎喪失,而對(duì)它們的底物結(jié)合常數(shù)和空間結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果推測(cè):LacTT的R290和D394的側(cè)鏈與底物之間存在相互作用,在突變之后可能這種作用力消失,從而影響了底物結(jié)合甚至是酶對(duì)底物的催化效率。(4)基于序列比對(duì)、同源建模和定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)LacTT的酸性氨基酸D106、E456、E356和D423及其作用機(jī)制進(jìn)行研究。D106、E456、E356和D423的突變體在600nm和330nm特征吸收峰值較野生型有所差異說明突變點(diǎn)對(duì)銅中心位點(diǎn)結(jié)構(gòu)都有較大擾動(dòng)。D106L、D106R、D106E的k_(cat)/K_m值只有野生型的20%-30%,推測(cè)因?yàn)樗鼈兊牡?06位殘基側(cè)鏈不能與T2Cu形成正確的水分子網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)致TNC中氧還原的受阻,引起催化活力下降。突變體E456L、E456R、E456D的酶催化活力幾乎喪失,是因?yàn)榈?56位的殘基側(cè)鏈不能正常向TNC提供質(zhì)子,使得TNC中氧的還原反應(yīng)無(wú)法正常進(jìn)行。位于T1Cu附近的E356A的k_(cat)/K_m值只有野生型的7%,K_m值是野生型的3.8倍,結(jié)合空間結(jié)構(gòu)研究,推測(cè)E356位點(diǎn)能接受來自底物的質(zhì)子,而且對(duì)酶與底物的結(jié)合起重要作用。D423A的k_(cat)/K_m值僅為野生型的一半,推測(cè)D423對(duì)TNC中氧的還原有重要影響。所以,D106、E456、E356和D423都是參與LacTT電子傳遞的關(guān)鍵氨基酸,而且,E356和D423位點(diǎn)是在細(xì)菌漆酶中首次發(fā)現(xiàn)對(duì)電子傳遞有重要影響的氨基酸殘基。(5)我們對(duì)漆酶LacTT的電子傳遞機(jī)制推測(cè)如下:在還原底物被氧化時(shí),底物的電子被T1Cu的配體組氨酸奪取,同時(shí)E356接受底物氧化所產(chǎn)生的質(zhì)子。T1Cu配體的組氨酸將來自底物的電子傳遞給T1Cu,隨后電子通過Cu-S(Cys)-N(His)三聯(lián)體傳遞至TNC,在氧還原的過程中,E456向TNC提供質(zhì)子,而D106和D423則協(xié)助TNC中O-O鍵的斷裂,將結(jié)合在TNC上的分子氧還原成水。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q55;Q78

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本文編號(hào)：2387502