【摘要】：【目的】構建中國榛屬植物主要栽培種平歐雜種榛實時熒光定量PCR內參基因的篩選體系,并篩選穩(wěn)定的內參基因,為榛屬植物的基因表達分析提供內參基因,進而為其植物資源利用和創(chuàng)新育種研究提供理論基礎。【方法】利用課題組前期對平歐雜種榛不同親和性授粉、授粉后不同時間的雌蕊轉錄組測序數(shù)據(jù),結合相關文獻搜索,共選取12個候選內參基因;以平歐雜種榛主栽品種‘達維’的盛花期雌蕊、未伸長期雄花序、幼嫩葉片、花粉、一年生枝形成層、嫩莖、根尖、根蘗等8個不同組織器官為研究材料;通過反轉錄PCR初篩,實時熒光定量PCR檢測表達量,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta Ct程序和Ref Finder在線網(wǎng)站評價內參基因的穩(wěn)定性�！窘Y果】反轉錄PCR初篩表明,12個候選內參基因引物的特異性良好,Cha STP5和Cha TF在不同組織器官材料中表達存在明顯差異,其余候選內參基因在8個組織中均有表達。實時熒光定量PCR的表達譜分析表明,Ch18S r RNA的表達量最高,Cha STP5表達量最低,其余10個候選內參基因均為中等表達量;Cha STP5和Cha TF的穩(wěn)定性最差,其余10個候選內參基因的穩(wěn)定性處于中等水平。ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct的結果表明,Cha Actin均排名第一,為最穩(wěn)定的內參基因,Ch18S r RNA的排名均在前五,而其他候選內參基因在不同程序分析結果中的排名存在差異。穩(wěn)定性綜合分析表明,Cha Actin和Ch18S r RNA的穩(wěn)定性良好,即在8個不同組織器官中表達量均一且在4個穩(wěn)定性分析程序中均排名靠前,適合作為內參基因;ge Norm程序的變異系數(shù)分析則表明,選取6個內參基因便可對RT-q PCR的數(shù)據(jù)進行精準的標準化處理;相關性分析表明,4個程序均在0.01水平上呈現(xiàn)顯著的相關性,Norm Finder和Delta Ct程序的相關性最高,Delta Ct與Best Keeper的相關性最低�！窘Y論】建立了平歐雜種榛實時熒光定量PCR內參基因的篩選體系:以反轉錄PCR初篩引物,熒光定量PCR分析引物特性及基因表達,4個程序單獨評價引物穩(wěn)定性,Ref Finder綜合分析選出最適穩(wěn)定內參基因,并選出榛屬植物8個不同組織器官中最為穩(wěn)定的2個內參基因Cha Actin和Ch18S r RNA。
[Abstract]:[objective] to construct the screening system of real-time fluorescence quantitative PCR for the internal reference gene of the main cultivated species of Corylus in China, and to screen the stable internal reference gene, and to provide the internal reference gene for the gene expression analysis of the genus Corylus. Then it provides a theoretical basis for the utilization of plant resources and the study of innovative breeding. [methods] using the data of different compatibility pollination and different time after pollination of Fructus heterophylla, combining with the relevant literature search, A total of 12 candidate internal reference genes were selected. Eight different tissues and organs, such as pistil, immature male inflorescence, young leaves, pollen, annual shoot cambium, tender stem, root tip, root tiller, etc. By reverse transcription PCR screening, real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression, and ge Norm,Norm Finder,Best Keeper,Delta Ct program and Ref Finder online website were used to evaluate the stability of internal reference gene. [results] reverse transcription PCR screening showed that, The specificity of 12 candidate endogenous reference gene primers was good, the expression of Cha STP5 and Cha TF in different tissues and organs was different, and the other candidate endogenous reference genes were expressed in 8 tissues. The expression profile of real-time quantitative PCR showed that the expression of Ch18S r RNA was the highest, and that of Cha STP5 was the lowest, and the other 10 candidate internal reference genes were all moderately expressed. The stability of Cha STP5 and Cha TF was the worst, and the stability of the other 10 candidate genes was at the medium level. The results of ge Norm,Norm Finder,Best Keeper and Delta Ct showed that, Cha Actin was the most stable gene. Ch18S r RNA ranked in the top five, while other candidate internal reference genes were ranked differently in different program analysis results. The stability analysis showed that the stability of, Cha Actin and Ch18S r RNA was good, that is, the expression levels of, Cha Actin and Ch18S r RNA were uniform in 8 different tissues and organs, and ranked first among the four stability analysis programs, so they were suitable as internal reference genes. The coefficient of variation analysis of ge Norm program showed that six internal reference genes could be used to standardize the data of RT-q PCR. The correlation analysis showed that the correlation between, Norm Finder and Delta Ct was the highest at 0. 01 level. The correlation between Delta Ct and Best Keeper was the lowest. [conclusion] A screening system for real-time fluorescent quantitative PCR gene of Corylus heterophylla was established: reverse transcription PCR primer, fluorescent quantitative PCR analysis primer characteristics and gene expression were established. Four programs were used to evaluate the stability of primer by comprehensive, Ref Finder analysis. The most stable internal reference genes Cha Actin and Ch18S r RNA. were selected from 8 different tissues and organs of Hazel.
【作者單位】： 西南大學農學與生物科技學院;中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所/國家林業(yè)局林木培育實驗室/林木遺傳育種國家重點實驗室;
【基金】：國家自然科學基金(31500560) 中國林科院基本科研業(yè)務費專項經(jīng)費(CAFYBB2016QB002)
【分類號】：S664.4

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