【摘要】：褐藻膠裂解酶是以海洋褐藻類中所含褐藻膠為底物制備具有多功能活性低聚褐藻寡糖的關(guān)鍵酶,對海藻資源的開發(fā)利用及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有很高的經(jīng)濟價值。實驗從皺紋盤鮑的腸道中篩選出一株具有高效產(chǎn)褐藻膠裂解酶的優(yōu)勢菌株,通過菌株菌落形態(tài)特征觀察,16S rRNA分子鑒定手段對菌株進(jìn)行了鑒定,同時對該菌株的最適發(fā)酵條件、最佳培養(yǎng)基配方、褐藻膠裂解酶基因Alg的異源表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)、分子特性等幾方面進(jìn)行了深入的研究,具體內(nèi)容如下:1.產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的篩選、鑒定與發(fā)酵條件的優(yōu)化。通過平板透明圈法從皺紋盤鮑腸道為樣品來源,篩選得到1株高效產(chǎn)胞外褐藻膠裂解酶的菌株SS-1,根據(jù)電子掃描顯微鏡觀察菌株形態(tài),菌落在平板中的形態(tài)特征以及16S rRNA基因的同源序列分析比對,鑒定該菌株為弧菌屬,命名為Vibrio sp.SS-1,提交到NCBI中得到Genbank號為KX266239。通過以菌株的培養(yǎng)溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速及接種量作為實驗單因素,確定了菌株SS-1的最適發(fā)酵溫度為30℃,最適生長pH值為7.2,接種量1.5%,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,并在最佳的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)28 h后,其酶活力可達(dá)38.6 U/m L,比酶活力115.2 U/mg。2.海洋弧菌SS-1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。在菌株SS-1的最佳發(fā)酵條件下,以不同的C源、N源及無機鹽等作為實驗單因素,通過PB實驗確定影響菌株產(chǎn)酶活力的顯著性因素(麥芽糖、酵母粉及磷酸氫二鉀),然后由最陡爬坡實驗逼近最大響應(yīng)值區(qū)域,采用BBD中心組合實驗找到海洋弧菌SS-1的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:麥芽糖11.86 g/L,酵母粉16.72 g/L,K2HPO_4 1.36 g/L,MgSO_4·7H_2O 1.5 g/L,FeSO_4·7H_2O 0.1 g/L,NaCl 6.75 g/L。在最佳培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng),驗證了酶活力達(dá)191.8 U/m L,比酶活力167.3 U/mg,相比較優(yōu)化前酶活力提高了4.97倍。3.海洋弧菌SS-1褐藻膠裂解酶基因Alg的異源表達(dá)。以海洋弧菌SS-1總DNA為模板,運用PCR技術(shù)克隆得到褐藻膠裂解酶基因Alg,成功構(gòu)建了重組表達(dá)菌株E.coli BL21(DE5α)/p ET28a(+)-Alg,經(jīng)1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)6 h,實現(xiàn)了重組蛋白的高效表達(dá)。誘導(dǎo)后的發(fā)酵液經(jīng)超聲破碎(功率15W,工作/間隙4s/8s,時間15 min)、Ni-NTA resin親和層析純化,檢測到蛋白分子量38.0 kD,純化倍數(shù)51.01倍,純蛋白回收率26%,酶活力達(dá)187.5 U/m L,比酶活力為138.9 U/mg。4.重組褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)及分子特性研究。以pH及穩(wěn)定性、反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性、金屬離子、底物特異性、動力學(xué)方程等方面深入研究了酶學(xué)特性。結(jié)果表明重組酶的最適反應(yīng)pH為8.0,在pH 4.0-9.0范圍內(nèi),30℃條件下保溫2 h,仍能保持60%以上的相對酶活力;最適反應(yīng)溫度為30℃,高于30℃條件下保溫2 h,其殘余酶活力損失40%以上;添加濃度1 mmol/L離子K+、Na+和Mg2+顯示對重組酶有明顯的促進(jìn)作用,Cu2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Al3+、SDS和EDTA等對該酶抑制作用較為明顯;動力學(xué)參數(shù)Km為5.93 mg/mL,Vmax為826.44 mg/(m L·min),偏好降解底物Poly(M);電離噴霧質(zhì)譜分析其降解褐藻膠產(chǎn)物主要不飽和二糖、三糖、四糖和五糖等小分子寡糖,其中以二糖的含量最高,因此說明,該重組酶是具有良好的酶學(xué)特性及有效底作用Poly(M)降解產(chǎn)生低聚寡糖的雙功能內(nèi)切酶,可應(yīng)用于褐藻寡糖的制備。同時,采用生物信息學(xué)方法對Alg推斷的序列重組酶蛋白進(jìn)行理化特性分析,預(yù)測了海洋弧菌SS-1褐藻膠裂解酶基因Alg編碼344個氨基酸,分子量約為38.8kD,等電點pI為4.80,其中帶負(fù)電荷氨基酸Asp和Glu總個數(shù)為50,帶正電荷的氨基酸Arg和Lys的總個數(shù)為34,故可推斷為一種堿性蛋白酶,與酶學(xué)性質(zhì)中重組蛋白理化性質(zhì)結(jié)果相一致。利用SWISS-MODEL在線以3hhf.1.A為模板,模擬該重組酶的空間三維結(jié)構(gòu)圖,分子結(jié)構(gòu)特性表明該重組蛋白酶為一種同源性為51.08%的低聚集單鏈的堿性蛋白酶分子,其中由大部分的不規(guī)則線性卷曲(約占44%)及少量的α-螺旋(約占27%)和β-折疊(約占27%)相互分散排列,由此推斷該重組酶穩(wěn)定性較差,與酶學(xué)性質(zhì)存在一定相關(guān)性。具有高度保守序列“NTKYARSELRA”、“GQIH”,決定著重組酶的催化活性的關(guān)鍵氨基酸,為后續(xù)運用基因定點突變改造褐藻膠裂解酶提高酶活力值提供了很好的依據(jù)。與Vibrio sp.QY101蛋白序列相似度為54.13%,推斷其可能是一種新的蛋白酶。隨著褐藻膠裂解酶研究的不斷深入,更多潛在的價值也會被不斷發(fā)掘,該研究為褐藻膠裂解酶的酶學(xué)性質(zhì)分析提供了很好的技術(shù)基礎(chǔ),為褐藻寡糖的制備提供很好的酶資源。
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【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ920.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 韓偉;林娟;謝勇;徐凡;葉秀云;;褐藻膠裂解酶基因的克隆表達(dá)及重組酶酶學(xué)性質(zhì)[J];微生物學(xué)通報;2017年05期

2 李麗妍;蘭，

本文編號：2379449