發(fā)布時間：2018-12-14 21:02

【摘要】：偽狂犬病(Pseudorabies)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的豬和多種家畜共患的一種急性,熱性傳染病。PRV主要感染豬,能夠?qū)е伦胸i的高死亡率和種豬繁殖障礙,對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。疫苗免疫是防控豬偽狂犬病的主要手段。然而自2011年底,PRV變異毒株在我國豬場出現(xiàn)并且流行,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。最新的研究顯示,現(xiàn)有商品化疫苗的保護效力顯著下降,不能有效阻斷這種變異株的傳播和流行。本研究旨在以當(dāng)前流行的PRV變異株(CH/HNSMX/2012株)為親本,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建gI、gE、TK三基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK,通過一系列動物試驗,研究了該毒株的安全性和免疫效力;為PRV變異株弱毒疫苗的研發(fā)與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。1.偽狂犬病病毒流行毒株的分離鑒定和致病力研究本研究從85份病料樣品中總共分離到16株P(guān)RV�？瞻咴囼烇@示這16株P(guān)RV的空斑面積相似(0.4-0.8mm2),均顯著高于經(jīng)典毒株Ea株(0.2-0.5mm2)。對這16株P(guān)RV進行g(shù)C基因測序和進化分析,結(jié)果顯示這16株P(guān)RV同源性非常高,和國內(nèi)近期公布的PRV分離株的gC基因高度同源;因此可以初步判定,這16株P(guān)RV均屬于PRV變異株。選擇PRV CH/HNSMX/2012株作為變異株的代表,通過小鼠和仔豬感染試驗研究其致病力。小鼠LD50試驗結(jié)果顯示CH/HNSMX/2012株和Ea株的LD50分別為19.5和154.2 TCID50。CH/HNSMX/2012株對小鼠的致病力顯著強于Ea株。使用CH/HNSMX/2012株通過滴鼻途徑感染60日齡仔豬,劑量分別為106.0、107.0、108.0TCID50;結(jié)果顯示所有感染組均出現(xiàn)發(fā)熱,食欲廢絕,典型的神經(jīng)癥狀和嚴重的呼吸道癥狀。106.0 TCID50感染組的5頭豬中有3頭仔豬死亡;而107.0和108.0 TCID50能夠?qū)е?頭仔豬全部死亡。2.基因缺失病毒rSMXΔgI/gEΔTK的構(gòu)建根據(jù)PRV基因組序列,選擇gI/gE和TK基因兩側(cè)的序列作為同源臂,構(gòu)建了重組轉(zhuǎn)移載體;將重組轉(zhuǎn)移載體和CH/HNSMX/2012基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細胞,獲得重組病毒;通過空斑純化,獲得純凈的不帶標(biāo)記的基因缺失毒株rSMXΔgI/gEΔTK。RFLP和Southern Blot試驗證明該毒株按照設(shè)計在gI/gE和TK兩個區(qū)域發(fā)生了缺失,而基因組其他位置沒有發(fā)生突變。rSMXΔgI/gEΔTK株的生長曲線和親本株相似,但是空斑面積顯著減小。細胞連續(xù)傳代試驗證明rSMXΔgI/gEΔTK遺傳穩(wěn)定。3.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK的安全性評價使用101.0-107.0 TCID50劑量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通過足墊注射接種Balb/c小鼠,觀察14d,接種小鼠未見臨床感染癥狀。使用102.0-107.0 TCID50劑量梯度的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通過皮下注射接種新西蘭大耳兔,觀察21d,沒有兔出現(xiàn)臨床感染癥狀。使用108.0 TCID50劑量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通過肌肉注射接種綿羊,觀察21d,結(jié)果沒有綿羊出現(xiàn)臨床癥狀;同欄飼養(yǎng)的綿羊沒有出現(xiàn)gB抗體轉(zhuǎn)陽的現(xiàn)象。使用108.0 TCID50劑量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通過肌肉注射和滴鼻兩種途徑,接種0日齡仔豬,觀察28d,結(jié)果沒有仔豬出現(xiàn)臨床癥狀,仔豬生長速度正常;每個感染組設(shè)置的哨兵豬gB抗體維持陰性。使用108.0 TCID50劑量的rSMXΔgI/gEΔTK株病毒,通過肌肉注射接種妊娠84日齡母豬;沒有母豬出現(xiàn)發(fā)熱,流產(chǎn)等臨床癥狀,出生仔豬數(shù)和仔豬的健康度和生長速度完全正常,和對照組沒有差異。綜上所述,PRV rSMXΔgI/gEΔTK株不能導(dǎo)致小鼠、兔、綿羊、新生仔豬、妊娠母豬等易感動物出現(xiàn)癥狀,僅具有有限的水平傳播能力,安全性較好,適合作為弱毒疫苗的候選毒株。4.基因缺失株rSMXΔgI/gEΔTK株對仔豬的免疫保護力評價分別使用106.0 TCID50劑量的rSMXΔgI/gEΔTK株弱毒疫苗,1頭份Bartha-K61株弱毒疫苗(Merial,France),或者1mL DMEM免疫28日齡PRV陰性仔豬1次,免疫后28天采血檢測抗體。中和試驗結(jié)果顯示rSMXΔgI/gEΔTK產(chǎn)生的血清中和抗體水平高于Bartha-K61疫苗。Bartha-K61疫苗產(chǎn)生的血清中和抗體中和Bartha-K61的中和效價顯著高于中和CH/HNSMX/2012株的中和效價;而r SMXΔgI/gEΔTK株疫苗沒有這個現(xiàn)象。免疫后28天使用CH/HNSMX/2012株滴鼻攻毒,劑量107.0TCID50;攻毒后對照組癥狀最嚴重,出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀和呼吸道癥狀,全部死亡。Bartha-K61組出現(xiàn)了嚴重的呼吸道癥狀,有3頭豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,失去飼養(yǎng)價值。rSMXΔgI/gEΔTK組僅表現(xiàn)出一過性發(fā)熱,輕微的精神沉郁和咳嗽,沒有神經(jīng)癥狀,攻毒后6天完全恢復(fù)。綜上所述,r SMXΔgI/gEΔTK能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較好的中和抗體,能夠有效保護變異株致死劑量的攻毒;而Bartha-K61株則不能提供有效保護。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.4

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李國江,趙悅,劉占江,靜海林;一起新生仔豬的偽狂犬病例[J];當(dāng)代畜牧;2000年06期

2 麥安國;某豬場新生仔豬發(fā)生偽狂犬病的防制報告[J];養(yǎng)豬;2000年04期

3 朱琪,李英霞,孫剛,邢文杰,張永國,劉洪雨,張加勇,楊春艷;某豬場發(fā)生仔豬偽狂犬病的診斷[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2001年01期

4 鮑偉華,王維金;寧波市規(guī)模豬場偽狂犬病的監(jiān)測及預(yù)防[J];浙江畜牧獸醫(yī);2001年01期

5 李覺慧,李國江;一起新生仔豬的偽狂犬病例[J];畜禽業(yè);2001年07期

6 李新萍,陶岳,葉丹;豬暴發(fā)偽狂犬病的診斷[J];畜禽業(yè);2001年11期

7 王文超,呂合星,劉勝利;一起仔豬偽狂犬病的診治與體會[J];中國動物檢疫;2001年06期

8 H.J.Batzazhu ,馮小宇;德國消滅偽狂犬病[J];中國畜牧獸醫(yī);2002年03期

9 程南雁,楊艷杰,楊瑞平,黃連順,趙國峰,姚興杰,劉長軍;黑狐偽狂犬病的診治[J];中國獸醫(yī)科技;2003年06期

10 袁森泉 ,Jake Waddilove;偽狂犬病的凈化[J];國外畜牧學(xué)(豬與禽);2003年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 秦榮香;吳志君;肖有恩;唐榮福;蔣志疆;;豬場偽狂犬病的凈化[A];中國豬業(yè)發(fā)展大會論文集[C];2005年

2 陳煥春;金梅林;何啟蓋;吳斌;方六榮;吳美洲;;偽狂犬病根除計劃[A];豬的重要傳染病防治研究新成果——中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業(yè)委員會第7次學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2002年

3 銀梅;王新華;王選年;;偽狂犬病研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)病理學(xué)分第12次暨中國動物病理生理學(xué)專業(yè)委員會第11次學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2003年

4 陳煥春;;偽狂犬病根除計劃[A];現(xiàn)代化養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)營管理研討會論文集[C];2004年

5 郭銘生;李鵬飛;曾健瀅;劉念;;偽狂犬病豬的組織病理學(xué)觀察[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜內(nèi)科學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

6 周運林;谷月如;梁田英;甄紅華;張澤紀;;某豬場爆發(fā)偽狂犬病的調(diào)查[A];豬的重要傳染病防治研究新成果——中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第五屆理事會第二次全體會議暨防檢疫專業(yè)委員會第7次學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2002年

7 祁小樂;崔保安;王學(xué)斌;徐端紅;;偽狂犬病最新流行動態(tài)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（上）[C];2003年

8 孫廣力;魏萍;楊本;郭昭林;;種豬場偽狂犬病防治經(jīng)濟成本和效益分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會論文集（上）[C];2003年

9 范鋒;姚靜;;成年奶牛感染偽狂犬病與流產(chǎn)之間相互關(guān)系的初步調(diào)查[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)分會成立大會暨第一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

10 周緒斌;Daniel Torrents Gil;李聰;栗娟;秦云;;2006年中國9省市規(guī)�；i場偽狂犬病野毒流行病學(xué)調(diào)查與分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第十二次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 北京獸藥研究所 王琴;偽狂犬病及其防治（未完待續(xù)）[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2000年

2 北京獸藥研究所 王琴;偽狂犬病及其防治（未完待續(xù)）[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2000年

3 中國獸藥典辦公室;偽狂犬病活疫苗質(zhì)量標(biāo)準[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2000年

4 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授 李文萍;偽狂犬病的診斷與治療[N];湖南科技報;2002年

5 倪艷秀 林繼煌;偽狂犬病[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2004年

6 萬芳;豬乙腦與偽狂犬病 雙價疫苗研究成功[N];農(nóng)民日報;2005年

7 臨城縣畜牧局 侯增海;新建豬場要嚴防偽狂犬病[N];河北科技報;2006年

8 ;偽狂犬病[N];河北科技報;2002年

9 北京獸藥研究所 王琴;偽狂犬病及其防治（上接10月29日三版）[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2000年

10 ;偽狂犬病雙基因缺失活疫苗[N];河南科技報;2004年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前3條

1 胡睿銘;偽狂犬病病毒變異株基因工程疫苗研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 徐志文;豬瘟偽狂犬病重組病毒活疫苗的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

3 陳陸;偽狂犬病基因缺失疫苗SA215研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 王美燕;海南省規(guī)�；N豬場偽狂犬病的凈化與防制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

2 彭峰;規(guī)�；i場偽狂犬病控制、凈化方案研究及推廣應(yīng)用[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 鄭霞;山東省部分地區(qū)規(guī)模化豬場偽狂犬病流行病學(xué)調(diào)查[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 賀紀云;我國部分規(guī)�；i場偽狂犬病野毒感染狀況調(diào)查及其凈化方案的初步研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

5 趙世文;吉林地區(qū)規(guī)模豬場偽狂犬病調(diào)查與防制[D];吉林大學(xué);2006年

6 王春花;gI/gE雙基因缺失偽狂犬病病毒變異株的構(gòu)建和免疫效力評價[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

7 張術(shù);偽狂犬病核酸疫苗及其佐劑的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

8 叢鑫;gE/gI/TK三基因缺失偽狂犬病病毒變異株的安全性和免疫原性評價[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 朱玲;偽狂犬病三基因缺失疫苗SA215免疫母豬后仔豬母源抗體消長規(guī)律及首免日齡的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2001年

，

本文編號：2379311