【摘要】：鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)是今年WHO剛剛公布的“耐藥性最強的TOP12”中的第一位,其對幾乎所有結(jié)構(gòu)類別的抗生素產(chǎn)生耐藥。多粘菌素被認(rèn)為是治療鮑曼不動桿菌的“最后一道防線”,但多粘菌素治療鮑曼不動桿菌感染亦存在諸多問題。盡管臨床分離到的鮑曼不動桿菌均表現(xiàn)為多粘菌素敏感型,但采用多粘菌素治療鮑曼不動桿菌感染的失敗率高達(dá)35%,表明醫(yī)院內(nèi)的治療失敗與傳統(tǒng)的耐藥菌無關(guān),可能與多粘菌素劑量不足引起細(xì)菌產(chǎn)生適應(yīng)性耐藥相關(guān)。因此,我們猜測鮑曼不動桿菌基因組可能存在“耐藥抑制基因”,在改變外在環(huán)境的情況下,“耐藥抑制基因”被“沉默”了,所以細(xì)菌變得耐藥。為了驗證“耐藥抑制基因”這個想法,我們聯(lián)合mariner轉(zhuǎn)座和多粘菌素篩選到一些耐藥突變株,定位并證明“耐藥抑制基因”的存在,為后續(xù)耐藥機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。本研究以利用mariner轉(zhuǎn)座系統(tǒng)聯(lián)合多粘菌素構(gòu)建的耐多粘菌素的突變株為研究樣本,首先采用反向PCR技術(shù)定位出部分耐多粘菌素突變株的mariner轉(zhuǎn)座子插入位點,將被中斷的耐藥相關(guān)基因克隆入回補載體(pSUTetAB)中,然后將各自的回補質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的突變株中,檢測突變株和回補突變株對多粘菌素的最低抑菌濃度(MIC)的變化,找出耐藥相關(guān)性較好的基因,采用RecETab重組系統(tǒng)定點敲除該基因,進(jìn)一步通過表型驗證該基因位點與耐藥相關(guān)性。最后采用細(xì)菌雙雜交技術(shù)對該位點進(jìn)行耐藥機(jī)理的初步探索。本研究成功采用反向PCR技術(shù)定位出耐多粘菌素突變株的6個轉(zhuǎn)座插入位點,通過構(gòu)建相應(yīng)的回補質(zhì)粒,比較突變株和回補突變株的多粘菌素MIC變化,找出與耐藥相關(guān)性較好的DJ41_1093(anti-anti-σ)位點,并進(jìn)一步利用RecETab重組系統(tǒng)定點敲除該位點基因驗證其耐藥相關(guān)性。此外,通過基因組標(biāo)注信息,找出與DJ41_1093可能互作的位點DJ41_848(anti-σ),利用細(xì)菌雙雜交實驗驗證密碼子優(yōu)化前后兩個基因之間的互作關(guān)系。初步實驗結(jié)果顯示,兩個基因之間未產(chǎn)生關(guān)聯(lián)性。
[Abstract]:Acinetobacter baumannii (Acinetobacter baumannii) was the first of the "most resistant TOP12" recently announced by WHO this year, producing resistance to almost all structural classes of antibiotics. Polymyxin is considered to be the "last line of defense" in the treatment of Acinetobacter baumannii, but there are many problems in the treatment of Acinetobacter baumannii infection by polymyxin. Although the clinical isolates of Acinetobacter baumannii showed polymyxin sensitive type, the failure rate of treatment of Acinetobacter baumannii infection with polymyxin was as high as 35%, indicating that the failure of hospital treatment was not related to the traditional drug-resistant bacteria. It may be related to the adaptive resistance of bacteria caused by insufficient dose of polymyxin. Therefore, we speculate that Acinetobacter baumannii genome may have a "drug resistance suppressor gene," in changing the external environment, the "drug resistance suppressor gene" is "silenced", so the bacteria become resistant. In order to verify the idea of "drug resistance suppressor gene", we combined mariner transposition and polymyxin to screen some drug resistant mutants, localize and prove the existence of "drug resistance suppressor gene", and lay a foundation for the further study of drug resistance mechanism. In this study, polymyxin resistant mutants constructed by mariner transposition system combined with polymyxin were used as the study samples. The mariner transposon insertion sites of some polymyxin resistant mutants were located by reverse PCR technique. The interrupted drug-resistance-related genes were cloned into the complementary vector (pSUTetAB), and then the respective complementary plasmids were transferred into the corresponding mutants to detect the changes of the minimum inhibitory concentration (MIC) of polymyxin in mutants and mutants. The gene with good correlation with drug resistance was identified, and the gene was knockout by RecETab recombination system, and the relationship between the gene locus and drug resistance was further verified by phenotypic analysis. Finally, bacterial two-hybrid technique was used to explore the drug resistance mechanism of this site. In this study, the reverse PCR technique was used to locate the six transposin insertion sites of polymyxin resistant mutants, and to compare the polymyxin MIC changes between mutants and mutants by constructing corresponding repair plasmids. The DJ41_1093 (anti- 蟽) locus, which has good correlation with drug resistance, was identified, and the drug resistance correlation was verified by knockout of the locus gene by RecETab recombination system. In addition, the possible interaction site DJ41_848 (anti- 蟽) with DJ41_1093 was found by genome tagging information, and the interaction between the two genes before and after codon optimization was verified by bacterial two-hybrid experiment. Preliminary results showed that there was no correlation between the two genes.
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378

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本文編號：2377068