【摘要】：隨著生物醫(yī)學的快速發(fā)展,基因標志物在現代醫(yī)學中的意義越來越重要,研究已經發(fā)現眾多與疾病的發(fā)生、發(fā)展等密切相關的基因標志物,包括基因多態(tài)性、體細胞突變、拷貝數變異以及基因甲基化水平異常等。通過檢測這些基因標志物,我們能夠實現對疾病的發(fā)病風險預測、早期診斷、療效監(jiān)測以及預后評估等。然而,由于基因標志物往往具有豐度低、序列差異小等特點,要求檢測方法具有較高的靈敏度、特異性及良好的定量性能,常規(guī)方法有時難以進行準確的檢測。數字化PCR技術是近年來發(fā)展的一種基于單分子PCR的新一代核酸定量檢測方法。其基本原理是將靶標分子分散到一個個微小體積的反應單元中,使每個反應單元中所含有的靶標分子數目不超過1個,在每個反應單元中獨立進行單分子PCR擴增反應,反應結束后對每個反應單元進行檢測,可以實現對初始核酸靶標的絕對定量。數字化PCR技術在定量精確度、準確性和靈敏度等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR方法,在核酸檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。本課題在前期研究基礎上,利用數字化PCR方法結合水凝膠微球陣列技術,實現了對糞便DNA中大腸癌相關的VIM基因甲基化水平異常的高靈敏、高特異性定量檢測,有望應用于基于糞便DNA檢測的大腸癌無創(chuàng)篩查中。然而,PCR擴增是一種基于模板擴增的方法,反應產生大量與模板分子序列一致的擴增產物,這些擴增產物可以作為下一次擴增反應的模板。因此,微量的"遺留擴增產物"污染就會導致假陽性結果的出現。核酸信號放大方法是一種通過模板分子觸發(fā)信號分子擴增的反應,不同于PCR、LAMP等模板擴增方法,在反應過程中模板分子本身的數量并沒有變化,而是靶標特異性的信號分子被循環(huán)放大,因此是避免擴增產物污染的理想方法。本課題在前期研究基礎上,提出將信號放大反應與數字化檢測相結合進行單分子計數檢測的新思路。首先采用可區(qū)分單堿基序列變化的結構特異性核酸侵入信號放大反應,將待測靶標放大并轉化為與模板序列無關的信號分子;再通過級聯(lián)反應將擴增的信號分子進一步放大,產生放大百萬倍以上的熒光信號分子,該熒光分子與靶標序列無關,但特異于靶標分子。為了實現基于核酸侵入反應的單分子數字化檢測,我們對目前核酸侵入反應存在的問題進行了改進。首先是如何提高核酸侵入反應對單堿基差異的識別特異性。理論上核酸侵入反應能夠識別侵入結構處的單個堿基差異,然而對不同位點的檢測過程中發(fā)現,有些位點的檢測存在非特異性反應信號,導致難以準確檢測單堿基差異。對此,我們提出在核酸侵入反應的下游探針中人為引入錯配堿基。通過優(yōu)化錯配堿基的位置及錯配堿基類型,顯著降低非特異性信號,提高了核酸侵入反應對單堿基差異檢測的特異性。其次,在常規(guī)的級聯(lián)核酸侵入反應中,下游探針會和熒光發(fā)卡探針形成一種稱為"X"型結構的非特異性結構。這種結構同樣能夠被FEN1核酸內切酶識別和切割,產生背景信號。在進行低拷貝靶標的檢測時,靶標分子產生的陽性信號較弱,此時背景信號會對檢測結果造成嚴重影響,使陽性結果和陰性結果無法有效區(qū)分。為了降低核酸侵入反應中"X"型結構產生的背景信號,我們提出了一種可控延伸反應介導的新型級聯(lián)核酸侵入反應原理。該方法中,通過在下游探針和熒光探針的雜交序列之間引入一段間隔序列,避免"X"型結構的形成,顯著降低背景信號。兩步核酸反應通過一種可控延伸反應進行橋聯(lián),形成信號放大。由于背景信號被抑制,陽性信號與背景信號區(qū)分明顯,相比于常規(guī)核酸侵入反應方法,檢測靈敏度提高約40倍,可利用該方法進一步建立單分子水平的核酸侵入反應。最后,我們將所建立的基于可控延伸反應的低背景級聯(lián)核酸侵入反應應用到微球-微乳相數字化擴增檢測體系中,顯著降低了陰性反應單元中的背景信號。利用所建立的基于微球-微乳相體系的低背景級聯(lián)核酸侵入反應,初步實現單分子信號擴增數字化檢測,陽性反應單元信號與陰性反應單元的背景信號有明顯的區(qū)分。我們所建立的基于信號擴增的數字化檢測方法有望成為一種高靈敏、高特異、無污染的核酸數字化檢測新方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R3416

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