【摘要】：隨著生物醫(yī)學的快速發(fā)展,基因標志物在現(xiàn)代醫(yī)學中的意義越來越重要,研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多與疾病的發(fā)生、發(fā)展等密切相關(guān)的基因標志物,包括基因多態(tài)性、體細胞突變、拷貝數(shù)變異以及基因甲基化水平異常等。通過檢測這些基因標志物,我們能夠?qū)崿F(xiàn)對疾病的發(fā)病風險預測、早期診斷、療效監(jiān)測以及預后評估等。然而,由于基因標志物往往具有豐度低、序列差異小等特點,要求檢測方法具有較高的靈敏度、特異性及良好的定量性能,常規(guī)方法有時難以進行準確的檢測。數(shù)字化PCR技術(shù)是近年來發(fā)展的一種基于單分子PCR的新一代核酸定量檢測方法。其基本原理是將靶標分子分散到一個個微小體積的反應(yīng)單元中,使每個反應(yīng)單元中所含有的靶標分子數(shù)目不超過1個,在每個反應(yīng)單元中獨立進行單分子PCR擴增反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后對每個反應(yīng)單元進行檢測,可以實現(xiàn)對初始核酸靶標的絕對定量。數(shù)字化PCR技術(shù)在定量精確度、準確性和靈敏度等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)的實時熒光定量PCR方法,在核酸檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,利用數(shù)字化PCR方法結(jié)合水凝膠微球陣列技術(shù),實現(xiàn)了對糞便DNA中大腸癌相關(guān)的VIM基因甲基化水平異常的高靈敏、高特異性定量檢測,有望應(yīng)用于基于糞便DNA檢測的大腸癌無創(chuàng)篩查中。然而,PCR擴增是一種基于模板擴增的方法,反應(yīng)產(chǎn)生大量與模板分子序列一致的擴增產(chǎn)物,這些擴增產(chǎn)物可以作為下一次擴增反應(yīng)的模板。因此,微量的"遺留擴增產(chǎn)物"污染就會導致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。核酸信號放大方法是一種通過模板分子觸發(fā)信號分子擴增的反應(yīng),不同于PCR、LAMP等模板擴增方法,在反應(yīng)過程中模板分子本身的數(shù)量并沒有變化,而是靶標特異性的信號分子被循環(huán)放大,因此是避免擴增產(chǎn)物污染的理想方法。本課題在前期研究基礎(chǔ)上,提出將信號放大反應(yīng)與數(shù)字化檢測相結(jié)合進行單分子計數(shù)檢測的新思路。首先采用可區(qū)分單堿基序列變化的結(jié)構(gòu)特異性核酸侵入信號放大反應(yīng),將待測靶標放大并轉(zhuǎn)化為與模板序列無關(guān)的信號分子;再通過級聯(lián)反應(yīng)將擴增的信號分子進一步放大,產(chǎn)生放大百萬倍以上的熒光信號分子,該熒光分子與靶標序列無關(guān),但特異于靶標分子。為了實現(xiàn)基于核酸侵入反應(yīng)的單分子數(shù)字化檢測,我們對目前核酸侵入反應(yīng)存在的問題進行了改進。首先是如何提高核酸侵入反應(yīng)對單堿基差異的識別特異性。理論上核酸侵入反應(yīng)能夠識別侵入結(jié)構(gòu)處的單個堿基差異,然而對不同位點的檢測過程中發(fā)現(xiàn),有些位點的檢測存在非特異性反應(yīng)信號,導致難以準確檢測單堿基差異。對此,我們提出在核酸侵入反應(yīng)的下游探針中人為引入錯配堿基。通過優(yōu)化錯配堿基的位置及錯配堿基類型,顯著降低非特異性信號,提高了核酸侵入反應(yīng)對單堿基差異檢測的特異性。其次,在常規(guī)的級聯(lián)核酸侵入反應(yīng)中,下游探針會和熒光發(fā)卡探針形成一種稱為"X"型結(jié)構(gòu)的非特異性結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)同樣能夠被FEN1核酸內(nèi)切酶識別和切割,產(chǎn)生背景信號。在進行低拷貝靶標的檢測時,靶標分子產(chǎn)生的陽性信號較弱,此時背景信號會對檢測結(jié)果造成嚴重影響,使陽性結(jié)果和陰性結(jié)果無法有效區(qū)分。為了降低核酸侵入反應(yīng)中"X"型結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的背景信號,我們提出了一種可控延伸反應(yīng)介導的新型級聯(lián)核酸侵入反應(yīng)原理。該方法中,通過在下游探針和熒光探針的雜交序列之間引入一段間隔序列,避免"X"型結(jié)構(gòu)的形成,顯著降低背景信號。兩步核酸反應(yīng)通過一種可控延伸反應(yīng)進行橋聯(lián),形成信號放大。由于背景信號被抑制,陽性信號與背景信號區(qū)分明顯,相比于常規(guī)核酸侵入反應(yīng)方法,檢測靈敏度提高約40倍,可利用該方法進一步建立單分子水平的核酸侵入反應(yīng)。最后,我們將所建立的基于可控延伸反應(yīng)的低背景級聯(lián)核酸侵入反應(yīng)應(yīng)用到微球-微乳相數(shù)字化擴增檢測體系中,顯著降低了陰性反應(yīng)單元中的背景信號。利用所建立的基于微球-微乳相體系的低背景級聯(lián)核酸侵入反應(yīng),初步實現(xiàn)單分子信號擴增數(shù)字化檢測,陽性反應(yīng)單元信號與陰性反應(yīng)單元的背景信號有明顯的區(qū)分。我們所建立的基于信號擴增的數(shù)字化檢測方法有望成為一種高靈敏、高特異、無污染的核酸數(shù)字化檢測新方法。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R3416

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本文編號：2376893