【摘要】：團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)是我們國(guó)家在淡水養(yǎng)殖魚(yú)類中占有舉足輕重地位的一個(gè)優(yōu)良品種,近些年,由于養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大化,養(yǎng)殖環(huán)境的惡化,集約化養(yǎng)殖程度的大幅度提高,各類疾病頻發(fā)。其中,對(duì)團(tuán)頭魴影響最大的就是由嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染引起的細(xì)菌性敗血癥,可導(dǎo)致魚(yú)體大量死亡。目前,還沒(méi)有快速有效的方法對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和治療。本研究用嗜水氣單胞菌感染團(tuán)頭魴區(qū)分抗病和易感組,通過(guò)PCR擴(kuò)增及測(cè)序在MHC Ⅱα基因上篩選單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphisms,SNP),利用高分辨率溶解曲線法和限制性內(nèi)切酶酶切法對(duì)SNP進(jìn)行分型,分析其多態(tài)性及與抗病性狀之間的關(guān)系。在MHC Ⅱα基因上共篩選出35個(gè)候選SNP位點(diǎn),占MHC Ⅱα基因總堿基的1.45%,包含30個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn),5個(gè)顛換位點(diǎn)。其中外顯子部分有16個(gè),內(nèi)含子部分7個(gè),5'非編碼區(qū)有1個(gè),3'非編碼區(qū)有11個(gè)。有13個(gè)SNP位點(diǎn)位于編碼區(qū),占總氨基酸位點(diǎn)的5.56%,位于839 bp的T/A顛換和1663 bp的A/G轉(zhuǎn)換是無(wú)義突變,其余11個(gè)SNP位點(diǎn)為有義突變。MHC Ⅱα基因的21個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(Peptide binding region,PBR)中,有4個(gè)位點(diǎn)變異,變異率為19.05%;而non-PBR的變異率僅為8.20%(5/61)。結(jié)果證實(shí)團(tuán)頭魴MHC Ⅱα基因含有豐富的多態(tài)位點(diǎn)、具有極高的特異性且對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了一定影響。α1結(jié)構(gòu)域的SNP位點(diǎn)分別占總堿基和總氨基酸位點(diǎn)的4.88%和10.98%,明顯高于α2結(jié)構(gòu)域的1.08%和3.22%。這是由于α1結(jié)構(gòu)域存在的抗原肽結(jié)合區(qū)具有高度的多態(tài)性,再次證實(shí)PBR位點(diǎn)存在于α1結(jié)構(gòu)域。表明抗原結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域的多態(tài)性高于非抗原結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性,同時(shí)也表明氨基酸的替代、替換集中出現(xiàn)在多肽結(jié)合位點(diǎn)上。NJ(Neighbor-joining)法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,團(tuán)頭魴MHC Ⅱα基因和數(shù)量眾多的硬骨魚(yú)類集聚成為一個(gè)分支,側(cè)面說(shuō)明了硬骨魚(yú)類應(yīng)該是單系起源的;另外,硬骨魚(yú)又一分為二,團(tuán)頭魴和別的鯉科魚(yú)類分了一支,鮭鱒魚(yú)類為另外一支,二者獨(dú)自進(jìn)化,互不影響。由此可見(jiàn),團(tuán)頭魴與鯉科魚(yú)類中的草魚(yú)(Ctenopharyngodon idella)關(guān)系最近,與斑馬魚(yú)(Danio rerio)、建鯉(Crprinus carpio jian)的關(guān)系稍遠(yuǎn),與大西洋鮭(Salmo salar)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的關(guān)系較遠(yuǎn),與其他脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物的關(guān)系最遠(yuǎn)。對(duì)分型成功的5個(gè)SNP位點(diǎn)在易感和抗病組中各100尾魚(yú)的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)位于1395 bp(T/A)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在易感和抗病組中差異極顯著(P0.01),位于221bp(G/T)和1859 bp(G/T)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率在易感組和抗病組中差異顯著(P0.05)。其中位于第三外顯子1395bp(T/A)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?引起了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變,進(jìn)而改變了魚(yú)體的抗病性。位于5'非編碼區(qū)221bp(G/T)位點(diǎn)和位于3'非編碼區(qū)1859bp(G/T)位點(diǎn)的突變沒(méi)有導(dǎo)致氨基酸改變,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻顯示與抗病關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果表明團(tuán)頭魴MHC Ⅱα基因的多態(tài)性和抗細(xì)菌性敗血癥性狀顯著關(guān)聯(lián),進(jìn)一步分析表明,純合個(gè)體對(duì)嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌性敗血病抗性更高。本實(shí)驗(yàn)初步分析獲得的相關(guān)SNP標(biāo)記及相應(yīng)的優(yōu)勢(shì)、劣勢(shì)基因型,能夠在進(jìn)行團(tuán)頭魴抗病育種工作時(shí)為親本的選擇提供理論依據(jù),也為分子遺傳標(biāo)記和團(tuán)頭魴抗病基因篩選奠定理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2372246