【摘要】：丁香假單胞獼猴桃致病變種(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起的細(xì)菌性潰瘍病是獼猴桃生產(chǎn)上一種毀滅性細(xì)菌性病害,該病害于1980年首次發(fā)現(xiàn)在美國加利福尼亞和日本靜岡縣,隨后蔓延至新西蘭、意大利、中國等地,此病害的流行給獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。gacA基因是一類廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的調(diào)控因子,調(diào)控著細(xì)菌的毒性及次生代謝產(chǎn)物。Psa在寄主選擇類型及致病流行條件方面與其他丁香假單胞細(xì)菌具有很大差異,然而,至今關(guān)于gacA基因在獼猴桃潰瘍細(xì)菌致病中的作用機(jī)制尚未見報道。因此本研究根據(jù)已知的丁香假單胞番茄致病變種(P.s.pv.tomato)中調(diào)控基因gacA的序列,利用生物信息學(xué)手段,從獼猴桃潰瘍菌的全基因組中克隆出gacA基因的同源基因。然后采用同源重組的方法構(gòu)建gacA基因的缺失突變體及回復(fù)突變體,并對其功能進(jìn)行初步分析。研究內(nèi)容如下:1.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的克隆及生物信息學(xué)分析根據(jù)來源于假單胞菌屬(Pseudomonas syringae)、芽孢桿菌屬(Bacillus Cohn)、黃單胞菌屬(Xanthomonas Campestris)、歐文氏菌屬(Erwinia amylovora)已報道的gacA基因,利用CLUSTALX軟件進(jìn)行序列分析,分析結(jié)果表明假單胞菌屬中g(shù)acA基因高度同源,相似性達(dá)98%。以獼猴桃潰瘍病菌野生型菌株AHP-18為供試菌株,根據(jù)假單胞菌屬中g(shù)acA基因的保守序列,設(shè)計特異性引物gacA3/gacA4,克隆得到gacA基因,測序驗證正確后,在NCBI上對測序結(jié)果進(jìn)行分析。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對Psa的GacA蛋白序列的進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果表明,Psa中GacA具有GacA相似蛋白的結(jié)構(gòu),GacA蛋白的N端具有一個REC結(jié)構(gòu)域,主要作用是接受信號感受蛋白傳遞來的磷酸基團(tuán);C端具有HTH結(jié)構(gòu),負(fù)責(zé)多極化以及和啟動子DNA結(jié)合。2.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因缺失突變體的構(gòu)建及篩選采用同源雙交換的方法對獼猴桃潰瘍病菌的gacA基因進(jìn)行缺失突變,首先設(shè)計特異性引物(gac-1U/gac-1R、gac-2U/gac-2R)擴(kuò)增出gacA基因的上下游同源臂片段,為了降低篩選突變株的難度,同時引入氯霉素抗性片段然后采用融合PCR技術(shù)構(gòu)建融合片段作為外源目的片段,測序驗證正確后,與自殺載體pK18mobsacB相連,構(gòu)建重組載體pK18gacA。本研究基于三親結(jié)合技術(shù)將重組載體轉(zhuǎn)入野生型菌株AHP-18中,經(jīng)過同源單交換,得到260株gacA基因單交換菌株,從單交換菌株中篩選得到雙交換菌株20株,即為gacA基因的缺失突變株。3.ΔgacA功能互補菌株的構(gòu)建及篩選設(shè)計特異性引物對(gac-F/gac-R)從菌株AHP-18擴(kuò)增出要補入的基因片段,并且在片段兩端同時引入合適的酶切位點(PstI/BamHI),將擴(kuò)增的外源片段及廣宿主質(zhì)粒pLAFR3分別酶切,然后以3:1進(jìn)行連接,構(gòu)建互補重組載體,然后基于三親結(jié)合技術(shù)將重組載體導(dǎo)入突變株△gacA基因組中,利用四環(huán)素抗性篩選得到陽性克隆,然后進(jìn)行菌落PCR驗證,正確的即為互補菌株。4.獼猴桃潰瘍病菌gacA基因的功能分析將野生型菌株、突變型菌株及恢復(fù)突變株分別接種獼猴桃活體枝條、離體葉片和煙草葉片,研究gacA基因的生物學(xué)功能。試驗結(jié)果表明,gacA基因參與調(diào)控了病菌的毒素和胞外酶合成,病菌的游動能力及致病性等,該基因的缺失導(dǎo)致病菌的產(chǎn)phaseotoxion毒素喪失、胞外酶合成和鞭毛游動能力下降以及致病力降低。
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【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S436.634

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本文編號：2357837