發(fā)布時間：2018-11-20 04:36

【摘要】：β-地中海貧血是最常見的單基因遺傳病(Monogenic Disorders,MGDs)之一,它是由位于人類第11號染色體上的HBB基因突變導(dǎo)致血紅蛋白合成不足或缺失而引起的血液系統(tǒng)疾病,對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。誘導(dǎo)多能干細胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs)技術(shù)為MGDs的治療提供了新的思路。利用傳統(tǒng)的基因定點編輯技術(shù)結(jié)合打靶載體即可對基因突變進行修復(fù),然而這種打靶效率極低,同時藥物篩選也會引起基因組小片段缺失或插入改變,這為臨床治療應(yīng)用帶來了一定的安全隱患。人工核酸酶技術(shù)尤其是CRISPR/Cas9(Clustered Regulatory InterspacedShort Palindromic Repeatassociated endonuclease 9)技術(shù)的發(fā)展為基因編輯提供了極大的便利,它構(gòu)建簡單、廉價,普通實驗室即可完成,大大提高了基因操作的效率及簡便性。在本研究中,我們建立了β-41/42(-TCTT)地中海貧血純合病人特異來源的多能干細胞系即β-iPSCs,利用單鏈供體寡核苷酸(single-strand oligodeoxynucleotides,ssODNs)、小分子化合物L(fēng)755507以及高保真CRISPR/Cas9(Clustered Regulatory InterspacedShort Palindromic Repeatassociated endonuclease9)核酸酶技術(shù)對β-iPS細胞進行基因修復(fù),顯著提高了同源重組(Homology-Directed Repair,HDR)修復(fù)效率,獲得了高效無痕的基因修復(fù)β-iPS細胞系;并且,全基因組外顯子測序并未檢測到脫靶現(xiàn)象;最后將病人特異性iPS細胞和基因修復(fù)后的iPS細胞分別進行體外定向誘導(dǎo)造血分化,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)錄水平上,基因修復(fù)后的iPS細胞能夠表達正常β珠蛋白。本研究為應(yīng)用干細胞對地中海貧血進行基因治療提供了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:尾 -thalassemia is one of the most common monogenic genetic diseases (Monogenic Disorders,MGDs), a blood system disease caused by a mutation in the HBB gene on human chromosome 11 that results in inadequate or absent hemoglobin synthesis. Pose a serious threat to human health. Induced pluripotent stem cell (Induced Pluripotent Stem Cells,iPSCs) technique provides a new idea for the treatment of MGDs. Gene mutation can be repaired by using traditional gene site-directed editing technique combined with targeting vector. However, such targeting efficiency is extremely low, and drug screening can also lead to the deletion or insertion of small genomic fragments. This brings certain safety hidden danger for clinical treatment application. The development of artificial nuclease technology, especially CRISPR/Cas9 (Clustered Regulatory InterspacedShort Palindromic Repeatassociated endonuclease 9, provides great convenience for gene editing. It is simple and cheap to be constructed, and can be completed in general laboratory, which greatly improves the efficiency and simplicity of gene manipulation. In this study, we established 尾 -41 / 42 (- TCTT) homozygous multipotent cell lines, 尾-iPSCs, using single-strand donor oligonucleotides (single-strand oligodeoxynucleotides,ssODNs). Gene repair of 尾-iPS cells by low molecular compound L755507 and high fidelity CRISPR/Cas9 (Clustered Regulatory InterspacedShort Palindromic Repeatassociated endonuclease9) increased the repair efficiency of homologous recombination (Homology-Directed Repair,HDR) significantly. A highly efficient gene repair 尾-iPS cell line was obtained. Moreover, no mismatch was detected by genomic exon sequencing. Finally, specific iPS cells and iPS cells were induced to differentiate into hematopoietic cells in vitro. The results showed that iPS cells could express normal 尾 -globin at the transcriptional level. This study provides a theoretical basis for the application of stem cells in gene therapy of thalassemia.
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R556.61

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本文編號：2343747