【摘要】：第一部分1型糖尿病模型DC亞型分化及致病性研究實驗背景目前研究認為大多數(shù)1型糖尿病是由患者自身免疫系統(tǒng)異常導(dǎo)致胰島β細胞特異性破壞與損傷,直至胰島素絕對缺乏,臨床上多表現(xiàn)為高血糖,低胰島素,并伴隨有多飲、多食、多尿和體重減輕等癥狀。在此過程中,患者樹突狀細胞攝取與呈遞胰島D細胞自身抗原,啟動T細胞攻擊,最終通過T細胞靶向殺傷破壞胰島p細胞,導(dǎo)致胰島素分泌減少,形成糖尿病。在這個過程中,除經(jīng)典DC(cDC)中CD8α+DC和CD11b+DC之外,人們還在1型糖尿病模型NOD(non-obese diabetic, NOD)小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)另一種CD8α-DC亞群,即mcDC。這種DC被認為具有更強的抗原遞呈能力和活化抗原特異性殺傷性T細胞能力,破壞NOD小鼠自身免疫耐受,故被認為具有高度致病性。此外,這三種細胞也被認為由相同的前體細胞分化而來。因此,通過動態(tài)研究這種三種DC亞群在NOD小鼠發(fā)病過程中的分化、組成,以及功能,將有助于深入認識1型糖尿病的發(fā)病規(guī)律。目的在自發(fā)性1型糖尿病模型NOD小鼠中觀察不同病程階段DC亞群分化、構(gòu)成的變化。重點觀察三種DC亞群特性和在T1 D發(fā)病過程中扮演的角色；探索體外誘導(dǎo)DC亞群分化的可能,以及探討DC亞群構(gòu)成的變化與1型糖尿病發(fā)展之間的關(guān)聯(lián)。方法雌性NOD小鼠隨機分為3組：6～8周齡組、10～12周齡組、16～18周齡組,每組7只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后取小鼠脾細胞利用流式細胞術(shù)測定CD11b+DC (CD11c+CD11b+CD8α-PDCA-1-)、CD8α+DC (CD11c+CD8α+CD11b-PDCA-1-)、mcDC(CD11c+CD11b+CD8-PDCA-1-)亞群的比例與構(gòu)成；分選上述DC亞群,分別測定其促T細胞增殖能力;ELISA法測定LPS刺激后各DC亞群分泌至上清中細胞因子水平,觀察刺激后DC促T細胞增殖能力的變化。分離8周齡NOD小鼠骨髓細胞,體外誘導(dǎo)后比較DC亞群的變化,以及測定培養(yǎng)上清中細胞因子水平。結(jié)果與8周齡NOD小鼠脾DC亞群比例相比,第12、1 6周可見CD8a+DC比例顯著降低;第16周可見mcDC比例顯著增加：在整個觀察過程中CD11b+DC比例無顯著變化。功能方面,與8周齡NOD小鼠脾DC亞群分泌細胞因子水平相比,CD8a+DC分泌的IL-10、TGF-β、IL-12p70有顯著降低;mcDC分泌TNF-α和IFN-γ有不同程度增加,特別是16周時IFN-γ水平呈顯著增加;CD11b+DC分泌TNF-α水平顯著上升而TGF-β顯著下降。mcDC促T細胞增殖能力逐漸增強,第12周和第16周顯著強于其余DC亞群；CD11b+DC與CD8α+DC的促T細胞增殖能力無顯著差異。骨髓細胞體外培養(yǎng)7天后其CD11b和CD11c分子表達顯著增加,其中CD11c增加約40倍,CDllb增加約15%。在DC亞群方面,CD11b+DC增加約20倍,mcDC加4-5倍,CD8α+DC幾乎消失。LPS刺激后其IL-12p70？TNF-α、IFN-y和TGF-β的分泌均有顯著增加。結(jié)論在NOD小鼠病程發(fā)展中,伴有CD8a+DC數(shù)量減少且功能減弱,mcDC數(shù)量增加且功能成熟,以及CD11b+DC功能炎癥化趨勢。即以CD8a+DC亞群和以mcDC與CD11b+DC為代表的CD8αDC亞群之間的失衡。這表明DC亞群組成及功能變化與NOD小鼠病程密切相關(guān)。另一方面,脾臟及骨髓中DC細胞分化及功能分析方法的建立為深入研究DC在NOD小鼠發(fā)病進程的作用提供了基礎(chǔ)。第二部分1型糖尿病模型Reg3g促進胰島p細胞增殖機制研究實驗背景Reg基因是Akiyama T等發(fā)現(xiàn)的一類具有保守C肽凝集素的基因家族,最初發(fā)現(xiàn)于再生胰腺組織中。早期研究發(fā)現(xiàn)Reg1,2的編碼產(chǎn)物可刺激胰腺導(dǎo)管上皮細胞新生為可分泌胰島素的p細胞；亦可促進胰島中殘余的p細胞增殖。根據(jù)基因序列及編碼產(chǎn)物的差異,Reg基因家族包括4個亞型。其中,Reg3基因又根據(jù)編碼長度和蛋白構(gòu)型差異分為α、β、γ、δ。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Reg3與胰島素原雙基因質(zhì)�？娠@著延緩STZ誘導(dǎo)的T1 D模型的發(fā)病時間和發(fā)病率,且體外實驗表明Reg3A可直接促進多種人胰腺癌來源的腫瘤細胞增殖。因此,我們設(shè)想,與Reg3A有類似結(jié)構(gòu)的Reg3g可能存在促進胰島細胞增殖的作用。目的觀察慢病毒介導(dǎo)的Reg3g基因在NOD小鼠體內(nèi)表達狀況,研究Reg3g表達對胰島細胞的影響和作用機制。方法8周齡雌性NOD小鼠隨機分為3組：對照組(15只)、eGFP-Lv組(20只)、Reg3g-Lv組(20只)。其中對照組給與腹腔注射無菌PBS 200μL,eGFP-Lv組小鼠行腹腔注射eGFP-Lv病毒液200μL,Reg3g-Lv組小鼠行腹腔注射Reg3g-Lv病毒液200μL。其中eGFP-Lv和Reg3g-Lv病毒液用無菌PBS稀釋至含2.58×1O6拷貝/200μL。從第8周開始,每周一次,連續(xù)4周。第12周每組隨機選取5只處死后收集樣本,包括血清、胰臟、脾臟、肝臟、腎臟及小腸。取多個內(nèi)臟切片觀察組織熒光表達,激光共聚焦觀察胰腺熒光部位及表達強弱。利用HE染色、Tunel檢測、PCNA染色、胰島素染色分析胰島部位的胰島炎程度,細胞增殖與凋亡,以及胰島部位胰島素合成狀況。收集胰腺胰島,利用Western blot法蛋測定胰島組織中JAK-STAT信號通路分子的表達。利用ELISA檢測血清胰島素水平。結(jié)果與對照組相比,可見HE切片中Reg3g-Lv組胰島局部淋巴細胞浸潤程度降低：免疫組化染色顯示胰島細胞核PCNA陽性細胞顯著增加：胰島細胞凋亡水平無顯著變化;胰島部位胰島素染色水平有顯著提升。第12周血清胰島素水平有顯著上升,第24周血清胰島素進一步上升。熒光顯微鏡觀察可見Reg3g-Lv組和eGFP-Lv組NOD小鼠肝、胰、脾、小腸均有較顯著的綠色熒光。激光共聚焦顯微鏡結(jié)合DAPI染色可見Reg3g-Lv組胰島有高強度綠色熒光,周邊非胰島胰實質(zhì)無顯著表達。胰島組織蛋白定量顯示,Reg3g-Lv組中有Reg3g過表達；eGFP-Lv組未見Reg3g過表達,與PBS對照組相比無顯著變化。在涉及胰島增殖的信號通路方面,Reg3g-Lv組JAK2、pJAK2、 STAT、pSTAT、NF-κB信號分子表達有不同程度增強,SCOS3表達亦有一定程度升高。截止27周,該組小鼠發(fā)病時間顯著后移,發(fā)病率顯著降低。結(jié)論Reg3g通過慢病毒介導(dǎo)成功高效地表達于NOD小鼠胰島細胞,通過活化JAK2/STAT3/NF-KB信號通路促進胰島p細胞增殖,促進胰島p細胞合成和釋放胰島素,逐漸恢復(fù)血清胰島素水平。最終延緩該組小鼠T1D發(fā)病時間與降低發(fā)病率。第三部分1型糖尿病模型Reg3g誘導(dǎo)機體免疫耐受機制研究實驗背景1型糖尿病的產(chǎn)生是一個漸進過程。在NOD小鼠模型中,病程早期即可見小鼠胰島周圍出現(xiàn)T細胞、DC、巨噬細胞等免疫細胞的浸潤,直接或間接損傷胰島p細胞。因此,改善機體的免疫失衡、消除或抑制局部炎癥將有助于緩解、改善糖尿病發(fā)生發(fā)展。有關(guān)Reg3的前期研究也表明,Reg3可與胰島素原聯(lián)合平衡STZ誘導(dǎo)模型小鼠體內(nèi)‘Th1 /Th2細胞因子的比例,抑制T細胞對胰島β細胞的破壞。鑒于本研究第二部分中觀察到Reg3g-Lv可顯著降低NOD小鼠胰島的淋巴細胞浸潤程度,延緩發(fā)病時間與降低T1D發(fā)病率,我們認為Reg3g-Lv還可能抑制細胞免疫功能誘導(dǎo)小鼠免疫耐受的形成與維持,保護p細胞,延緩T1DM發(fā)病。目的利用NOD小鼠模型,觀察Reg3g-Lv因素對小鼠樹突狀細胞和T淋巴細胞亞群數(shù)量及功能的影響,以及DC和T細胞的相互影響。結(jié)合小鼠血清中細胞因子和抗胰蛋白酶(al-AAT)結(jié)果探討Reg3g-Lv改善NOD小鼠免疫耐受的可能機制。方法收集第二部分中12周齡PBS組、eGFP-Lv組、Reg3g-Lv組脾來源DC、T細胞、血清樣本。流式細胞術(shù)檢測各組DC亞群及成熟度。半體外觀察DC功能,包括混合淋巴細胞反應(yīng)和誘導(dǎo)胸腺T細胞分化為Treg (CD4+CD25+Foxp3+)能力實驗。ELISA檢測LPS刺激DC后分泌1L-10、TGF-β、IL-12p70和α1-AAT水平。流式細胞術(shù)測定脾淋巴細胞中Treg亞群比例。半體外測定T細胞增殖能力和Th1/Th2細胞因子分泌水平.ELISA檢測血清中Th0/Th2細胞因子和α1-AAT水平。利用Western blot法測定肝臟JAK-STAT信號通路活化程度。體外觀察Reg3g蛋白對DC膜表面分子和T細胞增殖能力的影響。結(jié)果Reg3g-Lv組脾DC比例與PBS組和eGFP-Lv組的結(jié)果無顯著差異,但Reg3g-Lv組DC共刺激分子CD40、CD80、CD86有顯著降低。在DC亞群方面,該組CD11b+DC比例顯著降低,而mcDC和CD8α+DC無顯著變化。該組脾DC刺激T細胞增殖能力顯著減弱,而誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+T細胞能力有顯著增強。DC上清中IL-10和TGF-β水平顯著上升,IL-12p70顯著下降,α1-AAT無顯著變化。Reg3g-Lv組脾淋巴細胞中Treg比例顯著增加,增幅達20%。該組T細胞增殖能力顯著減弱,T細胞培養(yǎng)上清中TGF-β和IL-10水平有顯著升高,IFN-γ和IL-2水平顯著降低。Reg3g-Lv組NOD小鼠血清α1-AAT水平顯著升高。蛋白定量結(jié)果顯示肝臟中與α1-AAT合成有關(guān)的JAK2/STAT3/NF-κB信號通路有活化。未發(fā)現(xiàn)Reg3g蛋白對DC膜表面分子和T細胞增殖能力的直接影響。結(jié)論體內(nèi)Reg3g過表達有助于誘導(dǎo)DC不成熟,促進其免疫抑制性細胞因子的分泌,直接或間接誘導(dǎo)Treg分化;此外,還通過促進具有抗炎作用的α1-AAT的合成及分泌,發(fā)揮抗炎和促進胰島p細胞修復(fù)。結(jié)果提示Reg3g-Lv可通過促進自身免疫耐受,抑制NOD小鼠的細胞免疫反應(yīng),發(fā)揮抗T1DM作用。綜合以上三部分的結(jié)果,本研究顯示NOD小鼠體內(nèi)Reg3g過表達具有雙靶向功能：既可促進胰島β細胞增殖、恢復(fù)其分泌胰島素功能,又可誘導(dǎo)與維持NOD小鼠機體的自身免疫耐受。此基因治療延緩NOD小鼠的發(fā)病時間,降低發(fā)病率,為1型糖尿病的防治提供新的線索與方向。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.1

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本文編號：2337872