【摘要】：活性氧(reactive oxygen species,ROS)存在于生物體的活細胞內(nèi),是由氧分子(O2)的不完全還原產(chǎn)生,包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(HO)和過氧化氫(H202)。ROS在細胞中會損傷脂類、蛋白和核苷酸。如在豆科植物與根瘤菌共生形成瘤體的過程中,豆科植物會產(chǎn)生ROS作為一種防御機制,此時根瘤菌會遭受到ROS的威脅。然而,這些ROS信號又能夠促進結瘤因子的產(chǎn)生而且對瘤體的發(fā)育和固氮酶活性具有積極的作用。因此,根瘤菌如何應對宿主產(chǎn)生的ROS是成功完成共生固氮的一個關鍵問題。已有研究發(fā)現(xiàn),過氧化氫酶(catalase)是清除無機過氧化物最主要的一類酶。田菁根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)與毛萼田菁(Sesbania rostrata)形成的莖瘤,與根瘤相比,雖然面對更大的氧脅迫,但其固氮效率卻比根瘤高得多,因此研究田菁根瘤菌在共生固氮過程中如何應對ROS是一個非常好的模型。通過生物信息學方法確定了田菁根瘤菌catalase相關基因katG(azc_3290)及其調(diào)控基因oxyR(azc_4162)。然后對katG和otyR基因進行了框內(nèi)敲除。在體外條件下,測定WT、ΔkatG和ΔoxyR的生長曲線,結果發(fā)現(xiàn)katG和oxyR基因的敲除并不影響菌體的正常生長。為了檢測katG和oxyR基因的敲除對于其抗H202的影響,我們進行了抑菌圈實驗和殺菌實驗。結果發(fā)現(xiàn),與WT相比,ΔkatG對H2O2十分敏感,ΔoxyR對H202有一定的敏感性,沒有ΔkatG顯著,原因可能是OxyR是一個調(diào)控蛋白。為了進一步驗證上述結果,對這兩個基因進行了回復突變實驗,結果發(fā)現(xiàn)兩者在抗氧化能力方面都有部分回復。以上實驗證明了katG和oxyR基因在田菁根瘤菌抗ROS方面發(fā)揮重要的作用。據(jù)報道,在許多其他細菌中都存在OxyR對catalase的調(diào)控作用,如大腸桿菌。因此,我們也研究了田菁根瘤菌中OxyR對katG的調(diào)控作用,通過構建katG中間片段轉錄融合表達體系,在這個體系中報告基因lacZ是直接插入到田菁根瘤菌染色體的katG基因的中間位置,如此katG基因也被破壞。在WT和ΔoxyR菌株中檢測katG的表達量,結果發(fā)現(xiàn)在ΔoxyR中katG的表達量大幅度下降,而H202對于katG的表達沒有影響,這說明katG受OxyR正調(diào)控,但不受H2O2誘導。對數(shù)期和穩(wěn)定期都進行了同樣的實驗,得到的結論基本一致。而且ΔoxyR回復突變株在katG的表達上具有部分回復作用。為了進一步研究katG和oxyR基因在共生固氮過程中的作用。我們進行了結瘤實驗和固氮酶活性測定實驗,對WT、ΔkatG和ΔotyR的結瘤能力和固氮酶活性進行了測定。結果發(fā)現(xiàn)katG和oxyR基因的缺失會使田菁根瘤菌形成莖瘤的數(shù)量降低了 50%,同時固氮酶活性較WT相比降低了 60%。這說明katG和oxyR基因在共生固氮過程中具有十分重要的作用。由于katG和oxyR基因的缺失會影響其結瘤和固氮,因此對田菁根瘤菌中結瘤和固氮的關鍵基因nodA和nifA的表達情況進行了研究。我們構建了nodA和nifA翻譯融合質粒,在WT、ΔkatG和ΔoxyR菌株中檢測nodA和nifA表達。已知nodA基因的表達能夠被柚皮素誘導,在有或無柚皮素、有或無H2O2的條件下檢測,發(fā)現(xiàn)nodA在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表達基本沒有太大差異,而H202對于nodA的表達也沒有太大影響;對于nifA來說,其在無氮培養(yǎng)基中會被誘導表達,在有或無氮培養(yǎng)基、有或無H202的條件下檢測,發(fā)現(xiàn)其在WT、ΔkatG和ΔoxyR中的表達也基本沒有太大差異,而H2O2對其表達沒有影響。總之,在本實驗條件下katG和oxyR的敲除基本不影響nodA和nifA的表達。通過研究發(fā)現(xiàn),catalase相關基因katG在田菁根瘤菌共生固氮過程中發(fā)揮重要的作用,它的缺失直接影響到結瘤和固氮能力,并且在體外條件下受OxyR蛋白正調(diào)控,對于抵抗H202發(fā)揮著重要的作用。
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【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q939.114

【參考文獻】

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本文編號：2318164