【摘要】：低溫酯酶在低溫下具有高催化活性,使其在食品、洗滌和環(huán)境保護等工業(yè)領域有著更大的應用潛力。酯酶能酶解奶油產(chǎn)生奶酪特有香氣的中、短碳鏈脂肪酸,可用于奶制品香精基料的開發(fā)。冰川環(huán)境是較少受到人類活動影響的開放性系統(tǒng),蘊藏著豐富的低溫微生物及酶資源,近年來由于全球氣候變暖,冰川持續(xù)消融和退縮,使得開發(fā)其資源刻不容緩,目前成為極端微生物研究的熱點之一。本論文依托新疆天山1號冰川資源,篩選能水解奶油產(chǎn)生中、短碳鏈脂肪酸的低溫酯酶產(chǎn)生菌,通過常溫常壓等離子體(ARTP)誘變、基因工程等技術手段提高酶的產(chǎn)量,并進一步探討酯酶酶解稀奶油的工藝及參數(shù),同時利用現(xiàn)代食品風味分析手段對比分析并鑒定奶制品原料、低溫酯酶酶解產(chǎn)物、自制奶味香精及市售牛奶香精的揮發(fā)性風味物質(zhì),為開發(fā)新型低溫酯酶酶制劑提供重要的理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)從采自天山1號冰川沉積層的土樣和冰川融水樣中,分離出377株可培養(yǎng)細菌,通過重復序列PCR(rep-PCR)技術鑒定后,最終選取了61株菌落形態(tài)特征差異較大的菌株進行革蘭氏染色、細胞和形態(tài)特性的研究,并通過3種選擇培養(yǎng)基進行初篩,其中有10株菌在三丁酸甘油酯平板上出現(xiàn)較大透明圈,再通過酯酶活性測定確定出5株產(chǎn)酯酶能力較強的細菌,其中T1-39分解對硝基苯酚丁酸酯(pNPB)活力最強為8.96U/mL。同時對這5株產(chǎn)酯酶菌株的菌落形態(tài)、生理生化特征及分子生物學特性進行了分析鑒定,其中,菌株T1-39被鑒定為假單胞菌屬(Pseudomonas sp.),命名為Pseudomonas sp.T1-39,其16S r RNA基因序列的GenBank登錄號為KP780205。(2)研究了ARTP快速誘變菌株Pseudomonas sp.T1-39,并結(jié)合三丁酸甘油酯平板及pNPB酶活測定法進行篩選,獲得TB1、TB11、D3三株酶活較高的正突變菌株,通過遺傳穩(wěn)定性及生長規(guī)律的研究,確定了1株遺傳穩(wěn)定性好、增殖速率快的菌株TB11進行發(fā)酵產(chǎn)酶,其酶活力比原始菌株提高了3.45倍。通過培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的確定,得出突變株Pseudomonas sp.TB11產(chǎn)酯酶工藝為:以稀奶油為誘導劑,胰蛋白胨和硫酸銨為氮源,添加2%的PVA,初始pH 9.0,發(fā)酵溫度15℃,2%的接種量,裝液量20 mL/250mL,200 rpm的搖床轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵32 h,得到的酯酶命名為Est TB11,酶活力為58.92U/mL,是優(yōu)化前的1.48倍,是原始菌株Pseudomonas sp.T1-39酯酶的6.58倍。(3)采用硫酸銨沉淀、Q Sepharose FF離子層析和Superdex G75凝膠過濾層析對酯酶Est TB11進行了分離純化,并在此基礎上,對酯酶蛋白的相對分子質(zhì)量、肽指紋圖譜及N-端氨基酸序列進行了分析鑒定,采用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜(5800MALDI-TOF/TOF)確定酯酶蛋白的相對分子質(zhì)量為64.601 kDa,N-端的10個氨基酸序列為GVYDYKNLTT。進一步探討了純化后酯酶的酶學性質(zhì),得出最適酶反應pH為8.5,且在pH7.0~10.0的范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性,最適溫度為25℃,因此,在低溫條件下占有較好的優(yōu)勢。而且,EstTB11在15℃~35℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定,保溫720 min時,在15℃~25℃下持有約90%的殘余酶活,在35℃下約有80%的殘余酶活。45℃保溫60 min仍可保持約65%的相對酶活,表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性。同時研究表明,酯酶EstTB11在以p-NPB和p-NPC(C4~C5)為底物時表現(xiàn)較高的酶活,可見該酯酶對中、短碳鏈酯具有較好的催化作用,這也進一步闡釋了該酯酶在食品工業(yè)及奶制品增香方面具有潛在的應用價值。(4)研究了低溫酯酶Est TB11基因的克隆表達、重組蛋白的純化及性質(zhì)。通過染色體步移技術并結(jié)合Est TB11酯酶的氮端氨基酸序列,從Pseudomonas sp.TB11基因組擴增得到一段長為1848 bp的開放閱讀框,編碼615個氨基酸,并預測了酯酶的二級和三級結(jié)構(gòu);再通過構(gòu)建重組表達載體,在大腸桿菌Rosetta(DE3)中獲得表達,測得酶活力為10.67 U/mL,是原始菌株酶活的1.19倍,但與突變株酶活相比偏低,大部分表達蛋白以包涵體形式存在。表達后的蛋白通過鎳離子親和層析、透析獲得的重組蛋白restT復性成功,且該蛋白對中、短碳鏈的酯水解能力較強,其水解pNPB的比活力為195.03U/mg;進一步研究了重組酯酶的酶學特性,結(jié)果表明rest T最適作用溫度為20℃左右,最適pH為8.5,在終濃度為5 mmol/L的K+、Ba2+和Na+存在下對其有激活作用。(5)采用SPME-GC/MS和電子鼻檢測技術分析了稀奶油、酯酶restT酶解物、諾維信Palatase 20000L酶解物及兩種商品牛奶香精的揮發(fā)性化合物,并對香氣相似性進行了比較。通過兩種酶酶解工藝及酶解產(chǎn)物GC/MS圖譜的對比分析,表明低溫酯酶rest T在較低溫度下,甚至是4℃時具有較好的水解能力,能最大程度的保留酶解產(chǎn)物香氣組分,使獲得的奶香更加逼真;并采用電子鼻檢測技術對8種不同樣品進行處理,通過雷達指紋圖譜分析、PCA主成分分析及DFA數(shù)據(jù)分析,結(jié)果均表明,與酶解產(chǎn)物、商品牛奶香精相比,自制天然奶味香精與稀奶油、純牛奶原料的相似度更高,更接近于天然奶香味且區(qū)別于合成牛奶香精,為開發(fā)新型低溫酯酶酶制劑提供了重要的理論依據(jù)。同時,也進一步表明電子鼻技術可以輔助SPME-GC/MS分析技術,能夠迅速評價樣品的香氣品質(zhì)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：TS264.3

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本文編號：2308677