【摘要】：隨著社會(huì)的發(fā)展,人們越來越重視觀賞植物的經(jīng)濟(jì)、人文和社會(huì)價(jià)值,因此對觀賞植物的育種要求也越來越高。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾現(xiàn)象對菊花(Dendranthema×grandiflora)基因沉默和基因組穩(wěn)定性至關(guān)重要。為追求更多新穎奇特的育種目標(biāo),提出了利用RNAi技術(shù)調(diào)控菊花DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá),通過青蒿(Artemisia annua L.)嫁接傳遞RNAi信號,進(jìn)而改變菊花基因組DNA甲基化水平,從而誘導(dǎo)其發(fā)生性狀變異的育種新思路。本研究從甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因著手,通過RNAi調(diào)控該基因的表達(dá),促使菊花基因組DNA甲基化水平降低,進(jìn)而創(chuàng)造新的變異類型,主要研究結(jié)果如下:(1)菊花CmMET1基因部分核苷酸序列的多樣性分析通過DNAMAN軟件比對分析菊花“紫精靈”和青蒿MET1基因的cDNA全長核苷酸序列,選取4段核苷酸序列設(shè)計(jì)引物對9個(gè)菊花品種進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增,序列比對分析得出:只有引物Chry2擴(kuò)增的核苷酸序列在菊花品種之間同源性較低,相似率最高只達(dá)到63.74%,且這段序列也是菊花和青蒿之間的非同源序列;其他三對引物擴(kuò)增得到的核苷酸片段在菊花各品種中差異不明顯,有些品種間甚至沒有差異,相似率的比例范圍在97.43%-100.0%。(2)構(gòu)建RNAi載體選取不同菊花品種間的兩段保守序列,分別位于菊花CmMET1基因第2417到第2515個(gè)堿基以及第1601到第1767個(gè)堿基之間,在其兩側(cè)位置設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增片段長度分別是136 bp和184 bp。利用“酶切-連接”法成功將目的片段正反向連入RNAi空載體(DHpart27RNAiFADP1P4),并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。(3)建立菊花“紫精靈”和“國慶紅”莖段愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系(1)“紫精靈”莖段最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基:MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D,誘導(dǎo)率為76.7%;MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+1.0 mg/L 6-BA+0.8 mg/L NAA,分化率為75.3%;(2)“國慶紅”莖段最優(yōu)愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基:MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+2.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L 2,4-D,誘導(dǎo)率為63%;MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA,分化率為63.8%;(3)二者最優(yōu)生根培養(yǎng)基:MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉,生根率均達(dá)到100%。(4)RNAi載體轉(zhuǎn)入菊花將含不同目標(biāo)序列的RNAi載體轉(zhuǎn)入菊花“紫精靈”和“國慶紅”的愈傷組織。最終在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.4-0.5,卡納霉素濃度為10 mg/L的轉(zhuǎn)化條件下分別獲得“紫精靈”和“國慶紅”的轉(zhuǎn)化植株16株和14株,很多轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)生長緩慢,矮化,葉柄變長,葉片變少,葉片白化和死亡等現(xiàn)象。分別選取生長健壯的“紫精靈”和“國慶紅”的轉(zhuǎn)化植株8株和6株進(jìn)行卡納標(biāo)記篩選,得到6株和5株陽性轉(zhuǎn)化植株。再各選取2株陽性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因的表達(dá)量檢測,結(jié)果分析得出,“紫精靈”和“國慶紅”的陽性轉(zhuǎn)化植株甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因表達(dá)量分別為對照的54%、52.5%和53%、54.5%。(5)RNAi載體轉(zhuǎn)入青蒿青蒿愈傷組織在農(nóng)桿菌菌液OD600為0.5-0.6,卡納霉素濃度為8 mg/L的轉(zhuǎn)化條件下獲得8株轉(zhuǎn)化植株。與青蒿MET1基因序列同源性較高的RNAi載體的轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)葉柄變長,葉片變少,葉片缺刻變少變淺和死亡等現(xiàn)象。而與青蒿MET1基因同源性較低的RNAi載體轉(zhuǎn)化植株僅表現(xiàn)為矮化,生長緩慢,在8株轉(zhuǎn)化植株中選取健壯的5棵進(jìn)行卡納霉素標(biāo)記篩選獲得3株陽性轉(zhuǎn)化植株。再選取2株陽性轉(zhuǎn)化植株檢測甲基轉(zhuǎn)移酶MET1基因的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)表達(dá)量分別為對照的90.5%、95.5%。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S682.11

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本文編號：2307468