【摘要】：目的通過建立模擬人唇裂術(shù)后傷口愈合的兔上唇瘢痕模型,對此模型進行術(shù)后瘢痕生長的時間序列研究以明確兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕增生最嚴重程度所在時間。通過構(gòu)建p38MAPK基因沉默重組腺病毒干擾靶基因的表達,檢測不同時間點p38MAPK信號通路受阻后對兔模型上唇瘢痕的影響效果來尋找基因治療瘢痕的最佳時間以及探討Smad信號通路與p38MAPK之間的cross-talk(交叉對話)情況。從整體水平闡明腺病毒介導(dǎo)的p38MAPK基因沉默對兔上唇瘢痕模型的治療性作用的分子機制。為開拓對我國唇裂術(shù)后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。方法1.運用Millard's單側(cè)唇裂修復(fù)法完成兔上唇瘢痕模型的構(gòu)建。2.分別在術(shù)后2、3、4、5周測量瘢痕體積并進行肌成纖維細胞(MFB)的細胞計數(shù),隨后通過免疫組織化學染色和Western blot定性和定量檢測兔上唇瘢痕組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的含量。3.篩選p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列及構(gòu)建腺病毒載體。4.術(shù)后0周、1周、2周分別進行瘢痕組織p38MAPK基因沉默腺病毒轉(zhuǎn)染,然后在術(shù)后3周獲取標本,用四種方法(天狼猩紅染色、免疫組織化學染色、Western blot、Real-time PCR)分別定性、定量檢測p38MAPK及瘢痕形成相關(guān)因子(colⅠ、colIII、MMP1、TIMP1)的蛋白和mRNA的相對表達水平。5.Y 周時,用 Western blot 和 Real-time PCR 檢測 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3、p38MAPK及p-p38MAPK的mRNA和蛋白的相對表達水平。結(jié)果1.成功構(gòu)建兔上唇唇裂術(shù)后瘢痕模型。2.瘢痕體積和MFB細胞計數(shù)結(jié)果顯示,術(shù)后2周與術(shù)后5周,術(shù)后3周與術(shù)后4周無統(tǒng)計學意義(P0.05),術(shù)后2周與術(shù)后3周及4周均有明顯統(tǒng)計學差異(P0.01)。免疫組化染色結(jié)果顯示:術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA表達明顯多于術(shù)后2周、5周。Western blot結(jié)果顯示:術(shù)后3周、4周瘢痕組織中α-SMA蛋白表達較術(shù)后2周、5周增強,結(jié)果具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.成功篩選出p38MAPK基因沉默最有效shRNA序列并構(gòu)建了腺病毒載體。4.局部注射腺病毒后,天狼猩紅染色結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII表達明顯多于術(shù)后0周及2周,術(shù)后1周瘢痕組織中colⅠ表達明顯少于術(shù)后0周及2周。免疫組化染色結(jié)果顯示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII、MMP1表達明顯多于術(shù)后0周及2周,術(shù)后1周瘢痕組織中colⅠ、TIMP1表達明顯少于術(shù)后0周及2周。Western blot結(jié)果顯示:術(shù)后1周瘢痕組織中colIII及MMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達增強,術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAPK、colⅠ及TIMP1蛋白較術(shù)后0周及2周表達減弱。Real-time PCR結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中colⅢ及MMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周升高,術(shù)后1周瘢痕組織中p38MAPK、colⅠ及TIMP1的mRNA水平較術(shù)后0周及2周降低。5.術(shù)后1周注射腺病毒,Western blot結(jié)果顯示:與對照組相比,術(shù)后1周瘢痕組織中p-Smad2、p-Smad3及p-p38MAPK蛋白表達降低。Real-time PCR結(jié)果示:術(shù)后1周瘢痕組織中Smad2、Smad3及p38MAPK的mRNA水平較對照組降低。結(jié)論為研究基因治療唇裂術(shù)后瘢痕增生提供了兔上唇瘢痕模型,通過實驗可得術(shù)后3周及4周時瘢痕增生達最嚴重程度。在此之前1周局部注射腺病毒,靶基因沉默效果最佳,治療效果最好,并研究了 Smad與p38MAPK之間的cross-talk情況。從整體水平闡明腺病毒介導(dǎo)的p38MAPK基因沉默對兔模型上唇瘢痕的治療性作用的分子機制。為開拓對我國唇裂術(shù)后瘢痕增生高危人群的早期防治的新途徑奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R782.2

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本文編號：2301953