【摘要】：背景:氟伐他汀(fluvastatin,FV)隸屬羥甲戊二酰輔酶A(HMG-Co A)還原酶抑制劑家族,可以明顯降低血漿低密度脂蛋白水平。FV在肝臟中主要經細胞色素P450 2C9酶(CYP2C9)代謝,且CYP2C9基因具有明顯的多態(tài)性。在臨床上常將丹參制劑和他汀類藥物聯(lián)合應用于高膽固醇血癥等心血管疾病的治療,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丹參可明顯升高大鼠體內他汀類藥物的濃度,這個現(xiàn)象是否為他汀類藥物的體內代謝受到干擾而致尚不清楚,值得探究。目的:探究中藥丹參的八種組分(丹參素,原兒茶酸,原兒茶醛,丹酚酸B,隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ,丹參酮ⅡA)對HLMs催化FV代謝的影響;研究不同基因型重組酶催化代謝FV的差異,以及基于CYP2C9的基因多態(tài)性(*1*2*3)研究丹參組分對FV代謝的影響機制。方法:1.建立HLMs及重組酶孵育體系中FV的HPLC分析方法;2.建立FV在HLMs及重組酶中代謝的孵育體系及樣品處理方法;3.在實驗優(yōu)化孵育時間,酶蛋白濃度的基礎上,選取系列濃度的FV,擬合FV在HLMs中的酶代謝動力學曲線,求算酶動力學參數Km,Vmax和CLint,用以分析HLMs催化代謝FV的酶動力學特征;4.選取八種丹參組分:丹參素,原兒茶酸,原兒茶醛,丹酚酸B終濃度1,10,100μM,隱丹參酮,丹參酮Ⅰ,丹參酮ⅡA終濃度1,10,60μM,二氫丹參酮Ⅰ終濃度1,10,40μM,分別與底物FV(1μM)共同孵育,采用已建立的HPLC檢測方法獲得FV的峰面積,通過公式:剩余酶活性%=(滅活組FV峰面積-丹參組分組FV峰面積)/(滅活組FV峰面積-不加丹參組分FV峰面積)×100%,比較八種丹參組分對FV代謝抑制的剩余酶活性,初步判斷八種丹參組分對FV代謝的影響;5.在優(yōu)化孵育時間,酶蛋白濃度的基礎上,選取系列濃度的FV,擬合FV在CYP2C9*1,*2,*3重組酶中代謝的酶動力學曲線,求算酶代謝動力學參數Km,Vmax和CLint,比較不同基因型CYP2C9代謝FV的差異,分析CYP2C9基因多態(tài)性對FV酶代謝動力學特征的影響;6.基于CYP2C9基因多態(tài)性研究隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ對FV代謝的影響。系列不同濃度的隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ分別與FV(1μM)共同孵育,通過非線性曲線擬合求算IC50值;系列隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ濃度點,分別與FV(0.5,1,2μM)共同孵育,通過Lineweaver-Burk作圖和Dixon作圖求算Ki值。確定三種丹參組分對FV代謝的抑制作用,并比較不同基因型CYP2C9抑制FV代謝的差異,從而分析隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ對FV代謝影響的可能機制。7.數據處理與統(tǒng)計分析:論文中實驗數據都以均數土標準差(Mean±SD)表示,采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數據進行分析處理,組間差異用單因素方差分析(One-way ANOVA)和T檢驗,結果以P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義,P0.05表示差異無統(tǒng)計學意義。結果:1.研究中建立的HPLC檢測方法,符合HLMs及重組酶中FV的檢測要求,孵育體系中雜志不干擾樣品測定,特異性良好,線性范圍為0.1-16μM,定量下線為0.1μM,精密度,準確度,以及提取回收率均符合生物樣本分析的要求。2.建立的HLMs以及重組酶催化代謝FV的孵育體系以及樣品處理方法完全符合本實驗的要求,且在實驗中經過多次驗證,穩(wěn)定性良好。3.HLMs中的研究結果顯示:通過設置系列的孵育時間,蛋白濃度,我們探索得出FV在HLMs中最佳的孵育時間為100min,最佳的酶濃度為0.25mg/m L,0.1-16μM的FV在HLMs中代謝的酶動力學參數Km,Vmax,CLint數值分別為1.13±0.18μM,5.52±0.25pmol/min/mg,4.88μL/min/mg。4.HLMs中的研究結果顯示:在丹參素,丹酚酸B,原兒茶醛,原兒茶酸100μM和丹參酮ⅡA 60μM時,其介導FV代謝的剩余酶活性分別是90.37%,106.14%,92.70%,100.23%,101.40%沒有顯示出抑制作用,然而在10μM時,隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ對FV代謝的剩余酶活性分別為42.73%,14.52%,17.20%顯示出了明顯的抑制作用,因此我們選擇此三種丹參組分在CYP2C9的重組酶上進行下一步的實驗探索。5.CYP2C9*1,*2,*3重組酶實驗顯示:*1,*2,*3代謝FV的酶動力學參數Km分別是1.56±0.21,1.79±0.25,2.32±0.43μM;Vmax分別是41.75±1.67,26.55±1.08,12.85±0.79pmol/min/mg;CLint分別是26.71,14.86,5.53。統(tǒng)計比較兩個突變體(*2,*3)與野生型(*1)的Km,Vmax,CLint顯示*1的代謝活性大于*2,*3。6.隱丹參酮抑制CYP2C9*1,*2,*3代謝FV的IC50值分別為1.74±0.41,2.64±0.81,3.17±0.32μM(與*1相比P0.05),Ki值分別為1.52±0.69,3.84±0.95,4.53±0.43μM(與*1相比P0.05);二氫丹參酮Ⅰ抑制CYP2C9*1,*2,*3代謝FV的IC50值分別是0.19±0.09,0.56±0.16,1.52±0.34μM(與*1相比P0.01),Ki值分別是0.20±0.07,0.42±0.11,0.97±0.22μM(與*1相比P0.05);丹參酮Ⅰ抑制CYP2C9*1,*2,*3代謝FV的IC50值分別是1.12±0.20,1.61±0.36,2.36±0.33μM(與*1相比p0.05),Ki值分別是0.90±0.11,0.66±0.08,1.89±0.18μM(與*1相比p0.01),以上數據表明:隱丹參酮,二氫丹參酮Ⅰ,丹參酮Ⅰ對不同突變CYP2C9重組酶催化FV代謝均具有明顯的抑制作用,其中隱丹參酮,丹參酮Ⅰ對其顯示出中等強度的抑制作用,二氫丹參酮Ⅰ對CYP2C9*1,*2催化FV的代謝展示出強抑制作用,對*3顯示出中等強度的抑制作用,且差異有統(tǒng)計學意義。結論:綜上實驗研究我們得出如下結論:1.丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸B和丹參酮ⅡA對HLMs代謝FV無抑制作用;隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ卻顯示出明顯的抑制作用。2.CYP2C9*2(430CT)和CYP2C9*3(1075AC)突變可影響重組酶代謝FV的活性。3.隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ對不同基因型的CYP2C9重組酶代謝FV均有明顯抑制作用,但抑制程度存在差異,三者對野生型*1的抑制作用大于兩個突變型*2與*3,提示430和1075位突變可能是影響隱丹參酮、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅰ與CYP2C9結合的重要位點。
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【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【參考文獻】
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本文編號：
2297252
