【摘要】：研究背景我國(guó)是全世界肝癌的高發(fā)地區(qū)之一,其占我國(guó)惡性腫瘤死亡原因的第三位。早期肝癌往往不易發(fā)現(xiàn),一旦發(fā)現(xiàn)多數(shù)已屬中晚期,即使手術(shù)切除,大部分患者仍會(huì)在術(shù)后5年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。總的來說,肝癌的發(fā)生發(fā)展與基因組不穩(wěn)定和突變有密切關(guān)系,基因表達(dá)失控和蛋白調(diào)節(jié)紊亂現(xiàn)象的積累最終導(dǎo)致了肝癌的發(fā)生與發(fā)展。近年來,雖然在肝癌的臨床研究方面取得了很多進(jìn)展,如多蛋白激酶抑制劑—索拉菲尼用于肝癌的治療。但是肝癌早期診斷難,晚期治療效果差的現(xiàn)狀仍然沒有被改變。因此,深入理解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找新的治療及藥物靶點(diǎn)迫在眉睫。人類SUSD2基因位于22q11-q12,編碼蛋白含有822個(gè)氨基酸,為一類位于細(xì)胞質(zhì)膜的Ⅰ型膜蛋白,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括4部分：促細(xì)胞生成素B結(jié)構(gòu)域(Somatomedin B domain,SMB); AMOP; von Willebrand factor,type D結(jié)構(gòu)域(vWD); Sushi/SCR/CCP結(jié)構(gòu)域。其中AMOP是一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域,有研究表明,該結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞粘附有密切關(guān)聯(lián)。von Willebrand factor (vWF)屬于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子,該結(jié)構(gòu)存在于多種血漿蛋白中,細(xì)胞內(nèi)主要功能包括轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、膜運(yùn)輸和蛋白酶體作用。含有v WF結(jié)構(gòu)的多蛋白復(fù)合體的功能包括細(xì)胞粘附、遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等。近年來,SUSD2基因在腫瘤中的作用得到了一些學(xué)者的關(guān)注,口前的研究表明SUSD2在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌以及結(jié)直腸癌中都存在異常表達(dá),然而對(duì)于SUSD2基因在肝癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能還未見報(bào)道。因此,本課題以肝癌為對(duì)象,首先在臨床標(biāo)本中進(jìn)行SUSD2基因表達(dá)水平的檢測(cè),再通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)和下調(diào)該基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平進(jìn)行生物學(xué)功能研究,以期發(fā)現(xiàn)新的肝癌生物指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。研究方法1、采用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中肝細(xì)胞癌相關(guān)的兩個(gè)組織標(biāo)本表達(dá)譜基因芯片數(shù)據(jù)GSE17856、GSE45114,利用生物信息學(xué)軟件Qlucore Omics Explorer (QOE)分別分析并篩選出在肝細(xì)胞癌組織與癌旁正常肝組織中表達(dá)有差異的基因,合并兩組數(shù)據(jù),篩選出共同上下調(diào)表達(dá)的差異基因。利用DAVID在線分析這些共同表達(dá)差異的基因的通路及功能,結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)新的肝癌相關(guān)基因。2、采用熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)8例接受肝癌切除手術(shù)的患者標(biāo)本以及對(duì)應(yīng)癌旁正常肝組織中SUSD2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。3、通過免疫組化聯(lián)合組織芯片的方法,分析SUSD2在180例肝癌組織及16例正常肝組織中的表達(dá)水平以及SUSD2蛋白的細(xì)胞定位。采用ROC曲線確定SUSD2高表達(dá)的最佳取舍點(diǎn)(cut-off值)并初步分析SUSD2表達(dá)水平與肝癌患者的臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。4、利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將pcDNA3.1-SUSD2質(zhì)粒載體和psi-mH1-SUSD2質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入HepG2和SMMC7721細(xì)胞中,利用Western Blot進(jìn)行重組細(xì)胞SUSD2蛋白表達(dá)水平的鑒定。5、采用CCK-8法檢測(cè)上調(diào)和下調(diào)SUSD2表達(dá)水平后對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞增殖能力的影響。6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SUSD2表達(dá)水平的變化對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。7、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SUSD2表達(dá)水平的改變對(duì)HepG2和SMMC7721細(xì)胞遷移能力的影響。8、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SUSD2表達(dá)水平的改變對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響。研究結(jié)果1、肝細(xì)胞癌相關(guān)基因的篩選及生物信息學(xué)分析：利用QOE軟件篩選出共同差異表達(dá)基因353個(gè),其中共同上調(diào)基因171個(gè),下調(diào)表達(dá)基因182個(gè)。運(yùn)用DAVID在線分析軟件對(duì)這些差異基因進(jìn)行功能注釋和通路分析,發(fā)現(xiàn)這些基因的主要功能與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、氧化還原等有關(guān),還與p53信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路等相關(guān)。對(duì)差異基因進(jìn)行文獻(xiàn)挖掘,首次發(fā)現(xiàn)SUSD2基因可能與肝細(xì)胞癌有關(guān)。2、SUSD2基因在8例新鮮臨床樣本中的表達(dá)水平分析：利用q-PCR和Western Blot檢測(cè)8例接受肝葉切除手術(shù)的患者標(biāo)本以及對(duì)應(yīng)癌旁正常肝組織中SUSD2的表達(dá)情況,q-PCR結(jié)果顯示：8例臨床樣本中,7例肝癌組織的SUSD2 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示8例臨床樣本中,7例肝癌組織中SUSD2蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁正常肝組織,與q-PCR結(jié)果一致。3、利用免疫組化檢測(cè)SUSD2在180例肝癌及16例正常肝組織中的表達(dá)水平以及細(xì)胞定位。結(jié)果顯示：SUSD2蛋白主要分布在包漿和包膜。根據(jù)臨床病理資料(性別、年齡、pT、pN、pM、臨床分期、組織學(xué)分級(jí))繪制出的ROC曲線,結(jié)果提示陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞在所有腫瘤細(xì)胞數(shù)中所占比例超過52.5%為高表達(dá)�；诖俗罴雅R界值,在大部分腫瘤組織樣品中SUSD2呈現(xiàn)低表達(dá)(112/180),而在正常肝組織樣品中呈現(xiàn)高表達(dá)(16/16),兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)。進(jìn)一步分析SUSD2表達(dá)量與臨床病理特征間的關(guān)系,結(jié)果表明：SUSD2的表達(dá)量與pT分期(χ2= 33.175, P= 0.000), pN分期(χ2= 4.785, P= 0.029)、pM分期(χ2=4.620,P=0.032)、病理分級(jí)(χ2=5.198,P=0.023)、臨床分期(χ2=30.244,P=0.000)有關(guān),而與性別(χ2=0.31,P=0.861)和年齡(χ2=1.093,P=0.296)無顯著相關(guān)性。4、經(jīng)Western Blot檢測(cè),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SUSD2的HepG2細(xì)胞中SUSD2表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,轉(zhuǎn)染psi-mH1-SUSD2的SMMC7721細(xì)胞中SUSD2的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組。5、CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：提高SUSD2的表達(dá)水后,能夠?qū)epG2細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著的抑制作用(P0.05)；降低SUSD2的表達(dá)水平后能夠?qū)MMC7721細(xì)胞的增殖產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用(P0.05)。6、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SUSD2表達(dá)量的改變對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,上調(diào)SUSD2的表達(dá)水平后HepG2細(xì)胞的凋亡數(shù)量與對(duì)照組相比顯著增加(P0.05),下調(diào)SUSD2的表達(dá)水平SMMC7721細(xì)胞的凋亡數(shù)量較對(duì)照組顯著減少(P0.05)。7、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在過表達(dá)組,HepG2細(xì)胞遷移的相對(duì)距離較對(duì)照組顯著降低(P0.05),在干擾組,SMMC7721細(xì)胞遷移的相對(duì)距離較對(duì)照組顯著增加(P0.05)。8、Transwell基質(zhì)膠小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,結(jié)果顯示：在過表達(dá)組,HepG2細(xì)胞穿膜數(shù)較對(duì)照組顯著減少(P0.05),在干擾組,SMMC7721細(xì)胞穿膜數(shù)較對(duì)照組顯著增多(P0.05)。結(jié)論通過對(duì)兩組基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析及文獻(xiàn)挖掘,發(fā)現(xiàn)新的肝癌相關(guān)基因SUSD2。收集臨床標(biāo)本,分析SUSD2基因在臨床標(biāo)本中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)SUSD2(?)表達(dá)于肝癌組織而相對(duì)高表達(dá)于正常肝組織。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)SUSD2的表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān),SUSD2表達(dá)量越低,癌組織分化程度越低,臨床分期越高。在生物功能方面,分別建立了轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體和干擾載體的HepG2細(xì)胞株和SMMC7721細(xì)胞株；證明了上調(diào)SUSD2的表達(dá)量能顯著抑制細(xì)胞的增殖能力,抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；下調(diào)SUSD2的表達(dá)量能顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和遷移能力,抑制細(xì)胞的凋亡。綜合以上實(shí)驗(yàn),SUSD2參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展,且可能作為抑癌基因發(fā)揮作用,為進(jìn)一步理解肝癌的分子機(jī)制提供了新的視角,也為肝癌的診斷及治療提供了新的研究靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：2289326