【摘要】：蘋果樹腐爛病菌(Valsa mali var. mall),是蘋果樹上一種具有毀滅性的子囊菌類病原真菌,其在植物體內(nèi)可分泌木聚糖酶、纖維素酶和果膠酶等,來降解植物細(xì)胞壁促進(jìn)病原菌侵入寄主體內(nèi)。該病菌引起的蘋果樹腐爛病在中國(guó)已造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,由于缺乏對(duì)其致病基因和致病機(jī)理的了解,導(dǎo)致腐爛病尚無法得到有效控制。前期研究表明,腐爛病菌分泌的木聚糖酶是其關(guān)鍵致病因素之一。為了更好地了解木聚糖酶在腐爛病菌致病性中的作用,我們克隆了兩個(gè)木聚糖酶基因Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ,對(duì)兩個(gè)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,并對(duì)基因進(jìn)行了敲除,初步驗(yàn)證了基因功能。兩個(gè)木聚糖酶基因的序列分析結(jié)果顯示,Xylanase Ⅰ的cDNA包含5’端和3’端全長(zhǎng)為1626bp,開放閱讀框?yàn)?320bp,編碼蛋白的相對(duì)分子量為43.8kDa,等電點(diǎn)為4.4。根據(jù)其氨基酸序列比對(duì)顯示,其與糖基水解酶10家族有很大的同源性。根據(jù)已知10家族XynAS9的晶體蛋白結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)了Xylanase Ⅰ假定蛋白的3D結(jié)構(gòu),在空間結(jié)構(gòu)上呈“碗狀”,第149位和256位谷氨酸殘基被認(rèn)定為催化區(qū)域。Xylanase Ⅱ的cDNA包含5’端和3’端全長(zhǎng)為969 bp,開放閱讀框?yàn)?81 bp,編碼蛋白的相對(duì)分子量為23.8 kDa,等電點(diǎn)為5.29。根據(jù)其氨基酸序列比對(duì)顯示,其與糖基水解酶11家族有很大的同源性。根據(jù)已知11家族Xylanase 11C的晶體蛋白結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)了Xylanase Ⅱ假定蛋白的3D結(jié)構(gòu),在空間結(jié)構(gòu)上呈“右手半握狀”,第122位和第213位谷氨酸殘基被認(rèn)定為催化區(qū)域,第113位和第124酪氨酸氨基酸殘基被認(rèn)定為底物結(jié)合區(qū)域。構(gòu)建了兩個(gè)木聚糖基因的重組表達(dá)載體pET-Xylanase,并對(duì)其原核表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化。Xylanase Ⅰ重組蛋白的最佳表達(dá)條件為：0.5 mmol/L IPTG在30℃誘導(dǎo)12 h。Xylanase Ⅱ重組蛋白的最佳表達(dá)條件為：0.1 mmol/L IPTG在15℃誘導(dǎo)10h,且上清中有可檢測(cè)到木聚糖酶活性的可溶性蛋白。通過Western blot技術(shù)對(duì)重組表達(dá)蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果顯示分別在63 kDa和42 kDa有特異蛋白條帶。利用熒光定量RT-PCR技術(shù),對(duì)離體培養(yǎng)基和蘋果枝條中的兩個(gè)木聚糖酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明,基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加蘋果枝條提取物和燕麥木聚糖作為唯一碳源,在較高溫度下(25～30℃)均可誘導(dǎo)Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ的表達(dá),而添加葡萄糖作為唯一碳源,僅誘導(dǎo)了Xylanase Ⅰ的表達(dá)。腐爛病菌在對(duì)蘋果離體枝條和愈傷組織的侵染過程中,Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ的表達(dá)量顯著升高且一直持續(xù)表達(dá),暗示兩個(gè)木聚糖酶基因在腐爛病菌的致病性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在上述研究基礎(chǔ)上,對(duì)蘋果樹腐爛病菌的木聚糖酶基因Xylanase Ⅰ進(jìn)行了敲除,以進(jìn)一步驗(yàn)證其基因功能。利用Double-joint PCR將標(biāo)記基因與目的基因上下游連接,構(gòu)建基因敲除盒。通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法對(duì)目的基因進(jìn)行敲除,獲得139個(gè)敲除突變體。對(duì)突變體進(jìn)行PCR檢測(cè),僅獲得1個(gè)Xylanase Ⅰ基因的敲除突變體。對(duì)Xylanase Ⅰ基因敲除突變體進(jìn)行生物學(xué)特性和致病性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)敲除突變體在菌落顏色、菌落形態(tài)、菌落生長(zhǎng)速度與野生型菌株LXS080901相比,均沒有明顯差異,但將敲除突變體接種蘋果離體枝條,發(fā)現(xiàn)其致病力與野生型菌株LXS080901相比,顯著降低;測(cè)定發(fā)病組織中木聚糖酶活性發(fā)現(xiàn),敲除突變體產(chǎn)生的木聚糖酶活性明顯低于野生菌株的。表明Xylanase Ⅰ基因在蘋果樹腐爛病菌致病過程中具有重要作用。本研究對(duì)蘋果樹腐爛病菌的重要致病因子木聚糖酶進(jìn)行了基因克隆、表達(dá)分析并對(duì)基因功能進(jìn)行了驗(yàn)證,為今后進(jìn)一步全面解析蘋果樹腐爛病菌的致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.611.11

【參考文獻(xiàn)】

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1 李保華;王彩霞;董向麗;;我國(guó)蘋果主要病害研究進(jìn)展與病害防治中的問題[J];植物保護(hù);2013年05期

2 王彩霞;董向麗;張振芳;李桂舫;李保華;;2011年煙臺(tái)蘋果產(chǎn)區(qū)腐爛病發(fā)病情況調(diào)查與原因分析[J];植物保護(hù);2012年03期

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本文編號(hào)：2283066