【摘要】：【目的】核糖核酸酶III核酸內(nèi)切酶Dicer1是Micro RNA合成的關(guān)鍵酶之一,主要位于細(xì)胞胞質(zhì)中。在卵巢腫瘤的研究中,卵巢癌患者伴有Dicer1基因的異常調(diào)節(jié)往往提示預(yù)后不良。但是至今有關(guān)Dicer1基因如何影響卵巢癌的生物學(xué)特性和化療耐藥的研究并不是很清楚。因此本實(shí)驗(yàn)的研究主要目的是在卵巢癌細(xì)胞株C13K中,下調(diào)Dicer1基因可以誘導(dǎo)自噬參與卵巢癌的化療耐藥的探索�！痉椒ā勘緦�(shí)驗(yàn)主要的實(shí)驗(yàn)方法是:(1)運(yùn)用細(xì)胞增殖與毒性實(shí)驗(yàn)(CCK8)來檢測(cè)下調(diào)Dicer1基因后卵巢癌細(xì)胞株C13K順鉑的敏感性及半數(shù)抑制濃度(IC50)。(2)利用小干擾RNA(si RNA)技術(shù)進(jìn)行下調(diào)卵巢癌細(xì)胞株C13K中的Dicer1基的表達(dá)量和下調(diào)Dicer1基因后對(duì)順鉑的敏感性以及加入抑制自噬的藥物(3-MA)后是否逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應(yīng),其次通過蛋白質(zhì)印記(western blot)觀察Dicer1和自噬相關(guān)的關(guān)鍵基因(ATG5,LC3B)在下調(diào)Dicer1基因后卵巢癌細(xì)胞株C13K的表達(dá)量以及下調(diào)Dicer1基因并且順鉑處理后凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)的表達(dá)量。(3)通過透射電子顯微鏡及共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù),來觀察Dicer1基因下調(diào)以及順鉑處理后卵巢癌細(xì)胞的自噬體的變化。(4)通過流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),來觀察Dicer1-si,ATG5-si以及順鉑處理后細(xì)胞凋亡的情況。(5)通過運(yùn)用公共數(shù)據(jù)庫TCGA,我們研究了Dicer1基因和ATG5基因在卵巢癌病人中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系�！窘Y(jié)果】根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及現(xiàn)象,可以得到如下結(jié)果:(1)通過CCK8發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞株C13K在Dicer1基因下調(diào)后對(duì)化療藥物順鉑的耐藥性增加。(2)通過si RNA干擾和western blot發(fā)現(xiàn)下調(diào)Dicer1基因在卵巢癌細(xì)胞株(C13K)的表達(dá)后,凋亡蛋白(Caspase3,c-PARP)表達(dá)也降低且加入自噬抑制劑(3MA)可以逆轉(zhuǎn)這種耐藥效應(yīng)。(3)通過透射電子顯微鏡和熒光共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)Dicer1下調(diào)后以及順鉑處理后,自噬現(xiàn)象比較明顯。(4)在TCGA數(shù)據(jù)庫中,發(fā)現(xiàn)Dicer1基因表達(dá)量低的患者預(yù)后較差,自噬基因(ATG5)表達(dá)量高的患者預(yù)后不良。(5)我們把自噬形成的關(guān)鍵基因(ATG5)沉默以及使用藥物抑制自噬生成后,發(fā)現(xiàn)C13K對(duì)順鉑的敏感性增加�！窘Y(jié)論】通過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的結(jié)果分析,我們可以得出一個(gè)這樣的結(jié)論即在卵巢癌細(xì)胞株C13K中,Dicer1下調(diào)可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的耐藥,也許可以為我們以后的臨床實(shí)踐提供一種新的治療策略。
[Abstract]:[objective] ribonuclease III endonuclease Dicer1 is one of the key enzymes in the synthesis of Micro RNA, mainly in the cytoplasm of cells. In the study of ovarian neoplasms, ovarian cancer patients with abnormal regulation of Dicer1 gene often suggest poor prognosis. However, it is not clear how the Dicer1 gene affects the biological characteristics and chemotherapeutic resistance of ovarian cancer. Therefore, the main purpose of this study was to study in ovarian cancer cell line C13K, Down-regulation of Dicer1 gene can induce autophagy to participate in chemotherapeutic resistance of ovarian cancer. [methods] the main experimental methods in this experiment are as follows: (1) the cell proliferation and toxicity test (CCK8) was used to detect the C13K cis-sequence of ovarian cancer cell line after down-regulation of Dicer1 gene. Platinum sensitivity and half inhibitory concentration (IC50). (_ 2) using small interfering RNA (si RNA) technique to down-regulate the expression of Dicer1 in ovarian cancer cell line C13K and the sensitivity of Dicer1 gene to cisplatin and whether to add an anti-autophagy drug (3-MA) Reversing the drug resistance effect, Secondly, the expression of Dicer1 and autophagy related key gene (ATG5,LC3B) in ovarian cancer cell line C13K after down-regulation of Dicer1 gene and the expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) after down-regulation of Dicer1 gene and cisplatin treatment were observed by protein imprinted (western blot). (3) the expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) in ovarian cancer cell line after down-regulation of Dicer1 gene. Electron microscopy and confocal laser scanning microscopy, To observe the Dicer1 gene down-regulation and cisplatin treatment of ovarian cancer cells autophagy changes. (4) flow cytology, (5) by using common database TCGA, we studied the relationship between the expression of Dicer1 gene and ATG5 gene and prognosis in patients with ovarian cancer. [results] based on the above experimental data and phenomena, we studied the relationship between the expression of Dicer1 gene and ATG5 gene in patients with ovarian cancer. The results were as follows: (1) the chemotherapeutic drug resistance of ovarian cancer cell line C13K was increased after the down-regulation of Dicer1 gene by CCK8. (2) the expression of Dicer1 gene in ovarian cancer cell line (C13K) was down-regulated by si RNA interference and western blot. The expression of apoptotic protein (Caspase3,c-PARP) was also decreased and the drug resistance was reversed by the addition of autophagy inhibitor (3MA). (3) the down-regulation of Dicer1 and cisplatin treatment were observed by transmission electron microscopy and fluorescence confocal laser scanning microscope. Autophagy was more obvious. (4) in TCGA database, patients with low Dicer1 gene expression had poor prognosis. The prognosis of patients with high expression of autophagy gene (ATG5) was poor. (5) after silencing autophagy key gene (ATG5) and inhibiting autophagy with drugs, we found that C13K was more sensitive to cisplatin. [conclusion] based on the results of the above experimental data, we found that C13K was more sensitive to cisplatin. We can conclude that in ovarian cancer cell line C13K, down-regulation of Dicer1 induces autophagy and promotes the chemotherapeutic drug resistance of ovarian cancer cells to cisplatin. It may provide a new treatment strategy for our future clinical practice.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2278611