發(fā)布時間：2018-10-17 12:34

【摘要】：目的通過對比原發(fā)性肝癌原發(fā)灶與門靜脈癌栓樣本的基因差異,篩選出癌栓中高表達的特異性基因,利用RNA干擾、CCK8、Transwell等技術(shù)進一步探討篩選出的目的基因的生物學功能和在肝癌進展、轉(zhuǎn)移中的作用機制。方法結(jié)合臨床,利用早期收集的10例原發(fā)性肝癌伴門靜脈癌栓樣本,通過Illumina高通量測序技術(shù),篩選出門靜脈癌栓較原發(fā)灶中表達明顯上調(diào)的基因,運用NCBI BLAST對比結(jié)果報告分析系統(tǒng),根據(jù)Score、E Value、Identities等挑選出最具特異性的目的基因FLJ37396和TTC6。通過QPCR技術(shù)檢測正常細胞L-O2(NC)和普通肝癌細胞hep G2、三株高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞huh7、MHCC97H、HCCLM3共五組細胞中兩種目的基因的表達情況,分別設(shè)計合成靶基因的干擾RNA,轉(zhuǎn)染至五組細胞樣本,再用QPCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后細胞樣本中靶基因的表達量,用CCK8檢測細胞增殖情況,用Transwell檢測細胞的遷移、侵襲情況,并與轉(zhuǎn)染前作對比分析。結(jié)果1、10例肝癌伴門靜脈癌栓樣本經(jīng)Illumina測序,篩選出10個在癌栓中表達較原發(fā)灶明顯上調(diào)的特異性基因,其轉(zhuǎn)錄本ID分別是Novel Tr_536、Novel Tr_150、Novel Tr_1258、Novel Tr_1259、Novel Tr_1257、Novel Tr_298、Novel Tr_574、Novel Tr_590、Novel Tr_213、Novel Tr_1266。2、10個轉(zhuǎn)錄本分別通過NCBI BLAST對比結(jié)果報告分析系統(tǒng)比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastnPAGE_TYPE=Blast Se archLINK_LOC=blasthome),轉(zhuǎn)錄本對應(yīng)所翻譯的蛋白質(zhì)名稱分別為:(1)Novel Tr_536 Transmembrane protein FLJ37396 isoform X11(2)Novel Tr_150 Homo sapiens uncharacterized LOC105369364(LOC105369364)(3)Novel Tr_1258 Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like(LOC101059915)(4)Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like(LOC101059915)(5)Novel Tr_1257 Homo sapiens chromosome X open reading frame 49-like(LOC101059915)(6)Novel Tr_298 Homo sapiens neurofibromin 1(NF1)(7)Novel Tr_574 Homo sapiens gamma-aminobutyric acid type B receptor subunit 1(GABBR1)(8)Novel Tr_590 Homo sapiens chromosome 3,GRCh38.p7 Primary Assembly(9)Novel Tr_213 Homo sapiens tetratricopeptide repeat domain 6(TTC6)(10)Novel Tr_1266 Homo sapiens glycerol kinase(GK)。3、根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的編碼能力分值(大于9.5)、長度(1000-2500bp)、翻譯產(chǎn)物等條件篩選,排除Novel_Tr150(非編碼轉(zhuǎn)錄本)、Novel_Tr1258(長度4476bp)、Novel_Tr1259(長度4204bp)、Novel_Tr1257(長度4721bp)、Novel_Tr590(長度8031)、Novel_Tr298(翻譯產(chǎn)物為神經(jīng)纖維瘤相關(guān)蛋白)、Novel_Tr574(翻譯產(chǎn)物為γ-氨基丁酸B1型受體)、Novel_Tr1266(翻譯產(chǎn)物為甘油激酶)。Novel_Tr536編碼能力分值14.09,長度1567bp,翻譯產(chǎn)物跨膜蛋白FLJ37396,Novel_Tr214編碼能力分值9.65,長度1057bp,翻譯產(chǎn)物TTC6。兩者均符合條件,并具有未明確的生物學功能,且存在潛在影響細胞增殖、遷移、侵襲的能力,因此選取二者作進一步實驗探討。4、對L-O2、hep G2、huh7、MHCC97H、HCCLM3五組細胞樣本進行QPCR檢測,設(shè)定正常肝細胞組L-O2中基因FLJ37396表達量為1,則肝癌細胞組hep G2表達量為1.74,高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞huh7、MHCC97H、HCCLM3表達量分別為55.38、9.32、4.31;設(shè)定正常肝細胞組L-O2中基因TTC6表達量為1,則hep G2中表達量為1.36,而huh7、MHCC97H、HCCLM3中表達量分別為36.43、5.11、3.85。兩者表達量均在huh7細胞株中升高最為明顯,因此選取huh7細胞株進行后續(xù)RNA干擾實驗。5、對NC細胞、空細胞huh7、三株轉(zhuǎn)染后huh7細胞組si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3共五組細胞樣本進行QPCR檢測,并設(shè)定NC細胞對照組中基因FLJ37396表達量為1,則空細胞對照組中目的基因表達量為1.04,三株轉(zhuǎn)染si RNA細胞實驗組si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3目的基因表達量分別為1.92、0.35、0.043。根據(jù)轉(zhuǎn)染后基因表達量的結(jié)果說明,si RNA-1組目的基因表達量較轉(zhuǎn)染前明顯升高,干擾效果不理想,考慮靶點1未能有效敲減目的基因表達,可能與靶點1處于非編碼區(qū)或si RNA-1設(shè)計不佳等相關(guān);而si RNA-2、si RNA-3兩組目的基因表達量均較轉(zhuǎn)染前明顯下降,分別為轉(zhuǎn)染前0.35倍和0.043倍,達到預(yù)期干擾效果,其中靶點3干擾效果最佳,可以有效地敲減huh7細胞中FLJ37396的表達,效率達95%以上,因此選取靶點3進行后續(xù)對比實驗。6、對NC細胞、空細胞huh7、三株轉(zhuǎn)染后huh7細胞組si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3共五組細胞樣本進行QPCR檢測,設(shè)定NC細胞對照組中基因TTC6表達量為1,則空細胞對照組目的基因表達量為0.65,三株轉(zhuǎn)染si RNA細胞實驗組si RNA-1、si RNA-2、si RNA-3目的基因表達量分別為1.29、0.12、1.23。根據(jù)轉(zhuǎn)染后基因表達量的結(jié)果可以說明,si RNA-1、si RNA-3兩組目的基因表達量較轉(zhuǎn)染前稍有升高,干擾效果不理想,靶點1和靶點3未能有效敲減目的基因表達,可能與靶點處于非編碼區(qū)或si RNA設(shè)計不佳等相關(guān);而si RNA-2組目的基因表達量較轉(zhuǎn)染前明顯下降,為轉(zhuǎn)染前0.12倍,可以有效地敲減huh7細胞中TTC6的表達,效率達85%以上,因此選取靶點2進行后續(xù)對比實驗。7、對照組huh7和三組轉(zhuǎn)染實驗組si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6分別進行CCK-8實驗,酶標儀讀取待測樣品和空白對照在450nm處的OD值。第一天,空白對照組、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分別是0.147、0.133、0.142、0.145,第二天各組OD值分別是0.434、0.391、0.487、0.280,第三天各組的OD值分別是0.630、0.602、0.733、0.434。根據(jù)OD值結(jié)果顯示,干擾基因TTC6的表達明顯抑制了huh7細胞的增殖,而干擾基因FLJ37396的表達反而促進huh7細胞的增殖。8、對照組huh7和三組轉(zhuǎn)染實驗組si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6分別進行Transwell遷移和侵襲實驗,酶標儀讀取待測樣品和空白對照在570nm處的吸光值,然后根據(jù)OD值計算細胞的遷移和侵襲能力。Transwell遷移實驗中,空白對照組、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分別是0.260、0.235、0.173、0.153;Transwell侵襲實驗中,空白對照組、si RNA-NC、si RNA-FLJ37396、si RNA-TTC6的OD值分別是0.221、0.206、0.170、0.151。根據(jù)OD值結(jié)果顯示,干擾基因TTC6的表達抑制了huh7細胞的遷移和侵襲,干擾基因FLJ37396的表達同樣能抑制huh7細胞的遷移和侵襲。結(jié)論1、根據(jù)10例臨床肝癌伴門靜脈癌栓樣本篩選出10個在癌栓中表達較原發(fā)灶明顯上調(diào)的特異性基因,其中2個基因的轉(zhuǎn)錄本Novel_Tr536、Novel_Tr214編碼能力分值較高,長度適中,翻譯蛋白產(chǎn)物FLJ37396、TTC6具有未明確的生物學功能,且存在潛在影響細胞增殖、遷移、侵襲的能力,具有較高的深入研究價值。2、FLJ37396是一種跨膜蛋白,其中多種FLJ結(jié)構(gòu)蛋白已證實對不同腫瘤細胞的生長有影響,因此推斷FLJ37396很可能與肝癌的轉(zhuǎn)移等相關(guān),但該蛋白的編碼序列在官方?jīng)]有明確的信息,即編碼的蛋白在人的轉(zhuǎn)錄基因組中沒有存在定論,也就是說現(xiàn)在還沒有確認此基因編碼的蛋白在人基因組中的完整序列。3、TTC6即三四氨基酸重復(fù)域6基序,包含TPR結(jié)構(gòu),TPR結(jié)構(gòu)域是一種獨特的、完全由螺旋結(jié)構(gòu)組成的結(jié)構(gòu)域。在高等生物基因組中,TPR結(jié)構(gòu)蛋白是蛋白與蛋白間相互作用的常見媒介,是一類重要的分子伴侶。另外,熱休克蛋白(heat shock protein)是另一類重要的分子伴侶,大量研究表明TPR蛋白能與HSP70/90等熱休克蛋白結(jié)合,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象、活性、胞內(nèi)定位、水解等涉及細胞生長、分化的過程,從而實現(xiàn)對細胞周期、細胞凋亡、細胞活力的影響,因此TTC6很可能與肝癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)聯(lián)。4、根據(jù)五組細胞樣本QPCR檢測實驗結(jié)果顯示,FLJ37396和TTC6在普通肝癌細胞組hep G2中的表達量相對正常肝細胞組L-O2的表達量相差不大,而在MHCC97H,huh7以及HCCLM3三株高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞株中的表達量有顯著升高,提示FLJ37396和TTC6可能與肝癌的進展、轉(zhuǎn)移以及門靜脈癌栓的形成呈正相關(guān)。5、Huh7細胞在不同的si RNA終濃度條件下轉(zhuǎn)染率各有不同,經(jīng)不同濃度轉(zhuǎn)染探索后,得出轉(zhuǎn)染效率最高的終濃度為30n M,轉(zhuǎn)染率達95%以上。6、基因FLJ37396和TTC6分別有多個不同的RNA干擾靶點,兩者均能找到有效干擾靶點,經(jīng)干擾后基因表達量敲減均達90%以上;另一方面,部分靶點經(jīng)干擾后基因表達量反而明顯增加,可能與靶點處于非編碼區(qū)或si RNA-1設(shè)計不佳等相關(guān)。這表明RNA干擾的多變性和基因沉默機制的復(fù)雜性。7、CCK-8實驗結(jié)果顯示,干擾基因TTC6的表達明顯抑制huh7細胞的增殖,這進一步表明基因TTC6能促進肝癌細胞的增殖;而干擾基因FLJ37396的表達反而促進huh7細胞的增殖,因此基因FLJ37396可能抑制肝癌細胞的增殖,也可能通過其他途徑增強肝癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力。8、Transwell遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示,干擾基因TTC6和基因FLJ37396均能抑制huh7細胞的遷移和侵襲,這進一步表明了兩個靶基因促進了肝癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲能力�？傊�,本實驗收集了10個門靜脈癌栓及肝細胞癌原發(fā)灶臨床標本,采用Illumina高通量測序技術(shù),篩選出了癌栓較肝癌中10個明顯上調(diào)的基因,根據(jù)NCBI的BLAST系統(tǒng),挑選出了其中兩個符合相關(guān)要求的特異性基因FLJ37396和TTC6。通過QPCR,檢測正常肝細胞、肝癌細胞、包括huh7在內(nèi)的三株高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞中的兩種基因表達,結(jié)果均在huh7細胞中表達最高。以huh7細胞為載體,通過si RNA分別沉默兩種基因以干擾它們的表達,并通過CCK-8實驗檢測基因沉默細胞的增殖、Transwell實驗檢測該細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果證明,基因TTC6能促進肝癌細胞的增殖、TTC6和FLJ37396能促進肝癌細胞的遷移和侵襲。提示,此兩種基因與肝癌轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制相應(yīng)基因或蛋白表達可能為肝癌轉(zhuǎn)移的有效防治提供新的靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：2276675