【摘要】：DNA作為生命體主要的遺傳因子,在攜帶和傳遞上遺傳信息的起著至關(guān)重要的作用。然而各種非生物和生物的脅迫,如紫外、電離輻射、化學(xué)誘變劑、自由基、細菌病毒等都會導(dǎo)致DNA發(fā)生損傷,從而會引起DNA的物理和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變,進而產(chǎn)生細胞和遺傳毒害作用。這些損傷主要包括DNA堿基修飾、DNA單鏈斷裂、DNA鉸鏈、DNA雙鏈斷裂等。由于植物本身營固著的生活方式以及儲蓄能量而對于陽光的依賴性,使得在其維護基因組的完整性上更是面臨巨大的挑戰(zhàn),為了確保其基因組物理結(jié)構(gòu)的完整性和化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定性,植物已經(jīng)進化出了高效廣泛的DNA損傷的檢測和修復(fù)機制。在各種因素誘導(dǎo)的DNA損傷中,DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks,DSBs)是目前已知的最具毒性的損傷形式。生物體主要通過非同源末端連接修復(fù)通路(NHEJ)和同源重組修復(fù)通路(HR)兩種方式對其進行修復(fù)。鹽穗木(Halostachys caspica)屬莧科多年生灌木,是新疆荒漠地區(qū)典型的耐鹽植物。以其獨特的環(huán)境適應(yīng)能力成為研究耐鹽機制的理想材料。本課題組前期對鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組進行測序分析,發(fā)現(xiàn)了一類與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的且明顯上調(diào)的unigene,本研究從這些DNA損傷修復(fù)相關(guān)的unigene中挑選了2個與DSBs修復(fù)相關(guān)的基因:HcDNA聚合酶(HcDNApolλ)和減數(shù)分裂特異性重組蛋白(HcDMC1),其中DNApolλ通過非同源末端鏈接途徑參與DSBs的修復(fù),而DMC1參與同源重組修復(fù)途徑對DSBs進行修復(fù)。利用RECA克隆其基因全長,通過原核和真核酵母系統(tǒng)分析它們的鹽脅迫下耐受性的,以研究它們在DSBs修復(fù)中的作用,為深入研究鹽穗木耐鹽機制奠定基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:1.基于鹽脅迫下鹽穗木轉(zhuǎn)錄組測序的EST序列,利用RACE技術(shù)克隆獲得了鹽穗木DNA損傷修復(fù)基因HcDNA聚合酶λ(HcDNApolλ)基因,開放閱讀框1,335 bp,編碼444個氨基酸,生物信息學(xué)預(yù)測該基因編碼的蛋白定位于細胞核。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示,鹽穗木HcDN polλ基因?qū)儆贒NApolX家族成員,系統(tǒng)進化分析顯示鹽穗木HcDNA polλ為獨立的分支。實時熒光定量qRT-PCR分析表明,隨著在脅迫濃度的增加,HcDNApolλ的表達逐漸增強且在14d時達到峰值表明Hc DNApolλ基因的表達受鹽脅迫的誘導(dǎo)。為了進一步研究鹽穗木HcDNApolλ的鹽脅迫的耐受性,我們究構(gòu)建了含有鹽穗木HcDNApolλ的原核表達載體pET30a-HcDNApolλ,通過檢測添加不同濃度NaCl脅迫下重組菌的生長曲線,表明HcDNApolλ可以增強重組大腸桿菌的鹽脅迫耐受性。構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA-HcDNApolλ,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并浸染擬南芥,并純化了His-HcDNApolλ蛋白,制備獲得了滴度約為1:200000的抗HcDNApolλ的多克隆抗體,為以后檢測HcDNApolλ蛋白奠定了基礎(chǔ)。為在植物中驗證HcDNApolλ的功能奠定了基礎(chǔ)。2.根據(jù)前期克隆獲得的鹽穗木HcDMC1基因,以及鹽脅迫下的表達規(guī)律,表明HcDMC1受鹽脅迫誘導(dǎo)。為了深入研究鹽穗木HcDMC1的耐鹽性,本研究構(gòu)建了原核表達載體pET30a-HcDMC1,檢測了不同濃度NaCl脅迫下重組大腸桿菌的生長曲線。進一步純化了HcDMC1蛋白,制備獲得了滴度約為1:400000的抗HcDMC1的小鼠抗血清,為以后檢測HcDMC1蛋白奠定了基礎(chǔ)。進一步構(gòu)建了酵母表達載體pYES2-HcDMC1,檢測了不同濃度NaCl脅迫下重組酵母的生長狀況。結(jié)果表明HcDMC1可以增加重組大腸桿菌和重組酵母的鹽脅迫耐受性。構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIAHcDMC1,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌并浸染擬南芥,為在植物中驗證HcDMC1的功能奠定了基礎(chǔ)。以上結(jié)果顯示,鹽穗木HcDNApolλ和HcDMC1參與了植物對鹽脅迫的響應(yīng),能夠提高脅迫下重組菌的生長。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2269994