【摘要】：樺褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.exPers.)Pilat,是一種非常珍貴的藥用菌,菌核為主要藥用價(jià)值部位,其在抗腫瘤、抗高血壓、降血糖、提高免疫力等方面有顯著療效,一直深受人們的喜愛(ài)。然而樺褐孔菌野生資源十分稀少,且野生的樺褐孔菌在樺樹(shù)上要經(jīng)過(guò)10-15年才具有良好的藥用價(jià)值,因此樺褐孔菌人工栽培工作的探索迫在眉睫。目前樺褐孔菌菌核的栽培已取得成功,但產(chǎn)量較低,研究證明,胞外酶活性變化與菌核生長(zhǎng)關(guān)系密切,繼而本試驗(yàn)以樺褐孔菌JL01為試材,繼續(xù)在與菌核發(fā)育有關(guān)的胞外酶——纖維素酶的分子水平上展開(kāi)研究,為進(jìn)一步了解胞外酶的蛋白質(zhì)功能和分泌表達(dá)變化規(guī)律,以及建立高效的外源表達(dá)載體提供理論依據(jù),具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.克隆并獲得了樺褐孔菌JL01菌株中內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase,IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase,IO-BGL)的ORF序列,β-葡萄糖苷酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF序列完全吻合,而內(nèi)切葡聚糖酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)1092個(gè)堿基T缺失,導(dǎo)致ORF序列改變,得到了新的內(nèi)切葡聚糖酶ORF序列,新基因命名為eg I,eg I的ORF序列全長(zhǎng)為1149 bp,編碼382個(gè)氨基酸,推測(cè)的蛋白分子量為40.1 kDa,理論等電點(diǎn)為4.78,序列比對(duì)和功能分析鑒定后,確定其為纖維素酶糖苷水解酶第5家族;2.構(gòu)建了樺褐孔菌內(nèi)切葡聚糖酶基因(eg I)和β-葡萄糖苷酶基因(bgl)原核表達(dá)載體,并命名為pET-30a-eg I和pET-30a-bgl;3.IO-EG和IO-BGL原核表達(dá)載體pET-30a-eg I和pET-30a-bgl正確導(dǎo)入大腸桿菌BL21中,并獲得穩(wěn)定表達(dá)的蛋白,SDS結(jié)果顯示蛋白均以包涵體形式存在,IO-EG和IO-BGL重組蛋白分子質(zhì)量分別約為40 kDa和90 kDa;4.采用Ni-IDA蛋白純化試劑盒在變性條件下對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化,純化后的IO-EG蛋白純度為88%,IO-BGL蛋白純度為75%,透析濃縮后的IO-EG和IO-BGL蛋白濃度分別為0.5 mg·L-1和0.65 mg·mL-1,得到的蛋白質(zhì)量分別為3.0 mg和3.6 mg。5.將純化得到的蛋白進(jìn)行Western Blotting分析,IO-EG蛋白條帶單一,和理論分子量相符,IO-BGL蛋白條帶和理論分子量相符,但35 KDa附近出現(xiàn)雜帶,推測(cè)原因是IO-BGL蛋白降解。
[Abstract]:Betula obliquus Inonotus obliquus (Ach.exPers.) Pilat, is one of the most precious medicinal bacteria. Sclerotia is the main medicinal value. It has remarkable effect in anti-tumor, anti-hypertension, hypoglycemia and improving immunity, and has been loved by people all the time. However, the wild resources of Betula platyphylla are very rare, and the wild Betula platyphylla has a good medicinal value in birch trees after 10-15 years, so it is urgent to explore the artificial cultivation of Betula platyphylla. At present, the sclerotia of Betula platyphylla has been successfully cultivated, but the yield is relatively low. It is proved that the change of extracellular enzyme activity is closely related to the growth of sclerotia, and the JL01 of Betula platyphylla is used as the test material in this experiment. To continue to study on the molecular level of cellulase, an extracellular enzyme related to sclerotia development, in order to further understand the changes of protein function and secretion expression of extracellular enzymes, and to establish efficient exogenous expression vectors. The experimental results are as follows: 1. The ORF sequences of endoglucanase (endoglucanase,IO-EG) and 尾 -glucosidase (beta-glucosidase,IO-BGL) in JL01 strain of Betula obliquus were cloned and obtained. The ORF sequence of 尾 -glucosidase was in good agreement with the ORF sequence published in Gen bank. However, the ORF sequence of endoglucanase was aligned with the ORF sequence published in Gen bank, and 1092 base T deletions were found, which led to the change of ORF sequence, resulting in a new ORF sequence of endoglucanase. The total length of the ORF sequence named eg Igneg I is 382 amino acids, and the deduced molecular weight of the protein is 40.1 kDa, the theoretical isoelectric point is 4.78. After sequence alignment and functional analysis, it is identified as the fifth family of cellulase glycoside hydrolase; 2. The prokaryotic expression vectors of (eg I) and 尾 -glucosidase (bgl) were constructed and named as pET-30a-eg I, pET-30a-bgl;3.IO-EG and IO-BGL prokaryotic expression vectors pET-30a-eg I and pET-30a-bgl into E. coli BL21. The stable expression protein was obtained. The SDS results showed that the proteins existed in the form of inclusion bodies. The molecular weight of IO-EG and IO-BGL recombinant proteins were about 40 kDa and 90 kDa;4., respectively. Ni-IDA protein purification kit was used to purify the target protein under denaturation conditions. The purity of purified IO-EG protein was 88% and the purity of IO-BGL protein was 75.The concentration of IO-EG and IO-BGL protein after dialysis was 0.5 mg L-1 and 0.65 mg mL-1, respectively, and the protein contents were 3.0 mg and 3.6 mg.5., respectively. The purified protein was analyzed by Western Blotting. The band of IO-EG protein was single, which was consistent with the theoretical molecular weight, and the band of IO-BGL protein was consistent with the theoretical molecular weight, but the heterocyclic bands appeared near 35 KDa, presumably due to the degradation of IO-BGL protein.
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S567.3

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本文編號(hào)：2266034