【摘要】：試驗(yàn)旨在利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備輸卵管特異表達(dá)人溶菌酶(h LYZ)的重組禽腺聯(lián)病毒(recombinant avian adeno-associated virus,r AAAV)。參照已發(fā)表的h LYZ基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物,PCR擴(kuò)增h LYZ基因片段,亞克隆至含輸卵管特異表達(dá)盒和禽腺聯(lián)病毒(AAAV)兩側(cè)末端反向重復(fù)序列(inverted terminal repeat,ITR)的轉(zhuǎn)移載體中,獲得重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體p FB-AIOVLYZ,將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)抗性和藍(lán)白斑篩選,獲得重組穿梭質(zhì)粒r Bacmid-AIOVLYZ,在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒r Bac-AIOVLYZ。將其與表達(dá)AAAV結(jié)構(gòu)蛋白的重組桿狀病毒r Bac-VP及表達(dá)AAAV功能蛋白的重組桿狀病毒r Bac-Rep以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為5感染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞,72 h后收集細(xì)胞沉淀,并經(jīng)濾膜過(guò)濾、氯仿抽提和PEG沉淀,即為r AAAV-OVLYZ。電鏡結(jié)果顯示,病毒粒子大小約為20 nm,形態(tài)結(jié)構(gòu)與野生AAAV相似;PCR結(jié)果顯示r AAAV含有目的基因;體外細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)說(shuō)明r AAAV能介導(dǎo)h LYZ在輸卵管細(xì)胞中的特異表達(dá)。結(jié)果表明,本研究利用桿狀表達(dá)系統(tǒng)成功制備了輸卵管特異表達(dá)h LYZ基因的r AAAV,為h LYZ的大量制備奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:The aim of the experiment was to prepare the recombinant avian adenosine virus (recombinant avian adeno-associated virus,r AAAV).) expressing human lysozyme (h LYZ) by using baculovirus expression system. According to the published h LYZ gene sequence, a pair of primers were designed to amplify the h LYZ gene fragment and subcloned into the transfer vector containing the oviduct specific expression box and the reverse repeat sequence (inverted terminal repeat,ITR at the bilateral end of Avian adenovirus (AAAV). The recombinant baculovirus transfer vector p FB-AIOVLYZ, was obtained and transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells. After screening with resistance and blue and white spot, the recombinant shuttle plasmid r Bacmid-AIOVLYZ, was transfected into Sf9 insect cells mediated by liposome, and the recombinant baculovirus r Bac-AIOVLYZ. was obtained. The recombinant baculovirus r Bac-VP expressing AAAV structural protein and the recombinant baculovirus r Bac-Rep expressing AAAV functional protein were infected with (multiplicity of infection,MOI for 72 h. Chloroform extraction and PEG precipitation, i.e. r AAAV-OVLYZ. The results of electron microscopy showed that the size of the virus particles was about 20 nm, which was similar to that of wild AAAV. The results showed that r AAAV contained the target gene, and that r AAAV could mediate the specific expression of h LYZ in oviduct cells in vitro. The results showed that the r AAAV, which specifically expressed the h LYZ gene was successfully prepared by using the rod expression system in this study, which laid a foundation for the preparation of h LYZ.
【作者單位】： 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31302096) 江蘇省農(nóng)業(yè)支撐項(xiàng)目(BE2013415) 江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(NY-009)
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：2258053