【摘要】：鯉魚是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚類,同時(shí)也是世界上重要的淡水養(yǎng)殖和觀賞魚類,其在世界上的養(yǎng)殖范圍超過(guò)了100個(gè)國(guó)家,占到世界10%的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品份額。嗜水氣單胞菌廣泛分布于池塘,江河,湖泊等環(huán)境中,是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌,可以侵染脊椎動(dòng)物,包括人類,爬行動(dòng)物以及魚類,引起敗血癥等癥狀。在鯉魚養(yǎng)殖過(guò)程中,經(jīng)常有感染嗜水氣單孢菌并導(dǎo)致大量死亡的情況發(fā)生,為了更深一步探究鯉魚感染病原菌過(guò)程中相關(guān)免疫機(jī)制的應(yīng)答情況,我們利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鯉魚感染嗜水氣單胞菌后三個(gè)不同時(shí)期脾臟的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)定,一共得到了545,000,000個(gè)125bp讀長(zhǎng)的序列,每一個(gè)文庫(kù)都至少得到了兩千三百萬(wàn)個(gè)序列,所有的原始數(shù)據(jù)在去除掉模糊的、低質(zhì)量(Q20)和過(guò)短的(長(zhǎng)度小于20bp)核酸序列后,得到536,000,000個(gè)高質(zhì)量的序列。我們采用Cufflinks和Tophat等生物信息學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,在三個(gè)不同的時(shí)期(感染后4小時(shí),12小時(shí)和24小時(shí))共鑒定出2900個(gè)差異表達(dá)的基因,其中在4小時(shí)處顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為739和248,而在12小時(shí)處顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為953和481,在24小時(shí)處顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為941和704,在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)共同顯著上調(diào)和顯著下調(diào)的基因個(gè)數(shù)分別為243和18。我們隨機(jī)選取了23個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行熒光定量pcr驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析得到的數(shù)據(jù)與定量pcr試驗(yàn)得到的差異基因的表達(dá)情況基本一致,這也說(shuō)明了我們轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。通過(guò)對(duì)這些差異基因進(jìn)行g(shù)o富集分析,我們共獲得29個(gè)顯著富集的go類別,其中包括免疫反應(yīng),外部刺激反應(yīng),信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性,輔因子結(jié)合和應(yīng)激反應(yīng)等多種與機(jī)體免疫相關(guān)的類別,同時(shí)根據(jù)通路分析和相關(guān)基因功能注釋信息,我們篩選了一些在信號(hào)通路上非常重要的基因,這些基因極有可能參與了鯉魚應(yīng)對(duì)嗜水氣單胞菌的免疫反應(yīng),我們對(duì)部分基因進(jìn)行了逐一討論分析。為了在基因?qū)用娓蛹?xì)致的研究免疫相關(guān)基因在鯉魚中的免疫機(jī)制和表達(dá)情況,我們選擇了a型清道夫受體基因家族并對(duì)其序列結(jié)構(gòu),系統(tǒng)進(jìn)化,在健康鯉魚多個(gè)組織中和早期發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。我們?cè)邗庺~的基因組資源中一共鑒定出7條a型清道夫受體基因,分別是scara2-1,scara2-2,scara3-1,scara3-2,scara4-1,scara4-2和scara5,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行線性分析和系統(tǒng)分化的研究我們發(fā)現(xiàn)部分鯉魚a型清道夫受體基因可能出現(xiàn)基因復(fù)制和丟失現(xiàn)象;通過(guò)探究鯉魚a型清道夫受體基因在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況我們發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于鯉魚的早期發(fā)育過(guò)程中,且同源基因的兩個(gè)拷貝之間在不同的發(fā)育階段存在著相似表達(dá)譜。我們發(fā)現(xiàn)a型清道夫受體基因廣泛分布于鯉魚的九個(gè)健康組織中,但是又呈現(xiàn)一定的組織特異性。為了探究鯉魚a型清道夫受體基因在受細(xì)菌感染后的表達(dá)情況,我們選取免疫組織脾臟和粘膜組織腸道來(lái)進(jìn)行更深一步的研究。我們發(fā)現(xiàn)腸道中A型清道夫受體基因在感染嗜水氣單胞菌后4小時(shí)就立即出現(xiàn)了顯著高表達(dá),而在脾臟中這一情況則發(fā)生在12小時(shí)處,我們推測(cè)這可能與腸組織的免疫識(shí)別和脾臟組織的免疫清除有關(guān)。本文期望通過(guò)整體的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)和相關(guān)免疫基因的分析能有助于我們更好的理解魚體的在受病菌感染時(shí)的相關(guān)免疫機(jī)制,為更進(jìn)一步的分子輔助育種提供幫助。
[Abstract]:Cyprinus carpio is an important economic fish in China, and it is also an important freshwater aquaculture and ornamental fish in the world. It is cultured in more than 100 countries, accounting for 10% of the world's freshwater aquaculture products. Pathogens can infect vertebrates, including humans, reptiles and fish, causing septicemia and other symptoms. In carp culture, there are often cases of infection with hydrophilic monospora and leading to a large number of deaths. In order to further explore the immune response to the pathogenic bacteria in carp, we use high A total of 545,000,000 125 BP readout sequences were obtained from the spleens of carp infected with Aeromonas hydrophila at three different stages. Each library had at least 23 million sequences. All the original data were removed from the ambiguous, low-quality (Q20) and short (length less than 20b). We used Cufflinks and Tophat bioinformatics software to analyze the data. A total of 2 900 differentially expressed genes were identified at three different stages (4 hours, 12 hours and 24 hours after infection), of which 2 900 were significantly up-regulated and down-regulated at 4 hours. The number of genes significantly up-regulated and down-regulated at 12 hours were 953 and 481, respectively. The number of genes significantly up-regulated and down-regulated at 24 hours were 941 and 704, respectively. The number of genes significantly up-regulated and down-regulated at three time points were 243 and 18, respectively. The results of fluorescence quantitative PCR analysis showed that the expression of differentially expressed genes obtained by transcriptome analysis was basically consistent with that obtained by quantitative PCR test, which also showed the reliability of our transcriptome analysis results. In addition, many immune-related classes, including immune response, external stimulus response, signal transduction activity, cofactor binding and stress response, have been identified. Based on pathway analysis and functional annotation of related genes, we have screened some genes that are very important in signaling pathways. These genes are most likely involved in carp response. In order to study the immune mechanism and expression of immune-related genes in carp more carefully at the gene level, we chose a scavenger receptor gene family and its sequence structure, phylogenetic evolution, in many tissues of healthy carp. We identified seven scavenger receptor genes, SCARA 2-1, SCARA 2-2, SCARA 3-1, SCARA 3-2, SCARA 4-1, SCARA 4-2, SCARA 4-1, SCARA 4-2 and SCARA 5, respectively, from the genomic resources of common carp. Receptor genes may be duplicated and lost. By investigating the expression of scavenger receptor type a gene in carp at different developmental stages, we found that it was widespread in the early developmental stages of carp. Similar expression profiles existed between two copies of homologous genes at different developmental stages. In order to investigate the expression of carp scavenger a receptor gene after bacterial infection, we selected immune tissues from spleen and mucosal tissues from the intestine for further study. We speculate that this may be related to intestinal immune recognition and immune clearance of splenic tissues. We hope that the whole transcriptome expression and the analysis of related immune genes can be used in this study. It is helpful for us to better understand the immune mechanism of fish infected by pathogens and provide help for further molecular assisted breeding.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S943

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本文編號(hào)：2216852