發(fā)布時(shí)間：2018-08-29 17:46

【摘要】：本研究旨在克隆豬轉(zhuǎn)錄因子ELF4基因,體外表達(dá)ELF4蛋白并制備抗該蛋白的多克隆抗體。采用RTPCR擴(kuò)增豬ELF4基因,運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析其核苷酸和編碼氨基酸序列特征,將其克隆至原核表達(dá)載體pET28a,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-pELF4,轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)菌株,在不同溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表達(dá),重組pELF4蛋白(rpELF4)經(jīng)純化免疫雞制備抗pELF4抗體。結(jié)果表明,pELF4開放閱讀框?yàn)? 989bp(GenBank No.:KU097322),編碼662個(gè)氨基酸,該基因與已經(jīng)測定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次為89.4%、90.7%和81.1%,與牛等大動物的親緣關(guān)系相對較近,與人和小鼠親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn);結(jié)果顯示,成功表達(dá)了重組蛋白pELF4,rpELF4分子量為95ku,該蛋白以可溶性和包涵體兩種形式存在,在37℃條件下,以終濃度為0.8mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)8h包涵體表達(dá)量達(dá)到最高。第4次免疫后第13天,雞抗rpELF4抗體滴度達(dá)到1，

本文編號：2211949