丹參(Salvia miltiorrhize Bunge)是唇形科鼠尾草屬多年生藥用植物,具有活血通心、祛癖生新、涼血解癰等多種功效,臨床上廣泛用于多種疾病的預(yù)防與治療。丹參水溶性酚酸類物質(zhì)作為其主要的藥用成分,越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。我們前期研究發(fā)現(xiàn),丹參R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1夠作為一個(gè)重要的調(diào)控蛋白參與調(diào)控酚酸類物質(zhì)的生物合成。目前關(guān)于SmPAP1的研究主要集中在其對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式,但是作為一個(gè)重要的調(diào)控蛋白,有關(guān)其自身基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究還未見報(bào)道,亟待補(bǔ)充。對(duì)SmPAP1啟動(dòng)子區(qū)保守DNA序列元件的分析結(jié)果顯示,在其啟動(dòng)子的不同區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)潛在結(jié)合植物MYB類轉(zhuǎn)錄因子的順式作用元件,推測(cè)在丹參中SmPAP1可能作為一個(gè)正向調(diào)控蛋白結(jié)合于自身基因啟動(dòng)子從而激活自身基因表達(dá)。鑒于此,本研究采用由SmPAP1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的報(bào)告載體,利用瞬時(shí)表達(dá)報(bào)告基因檢測(cè)法和葉盤轉(zhuǎn)化法分別在體外及體內(nèi)探究SmPAP1是否能夠激活其自身基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí),為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1在丹參次生代謝途徑中的潛在調(diào)控作用及分子作用機(jī)制,對(duì)丹參野生型及SmPAP1過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析,探究在丹參中由SmPAP1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的差異表達(dá)基因可能行使的生物學(xué)功能及參與調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程。本研究結(jié)果如下：1.利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù),將效應(yīng)載體35S::SmPAP1和報(bào)告載體SmPAP1-promoter::GUS在煙草表皮細(xì)胞中進(jìn)行共表達(dá),通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平間接分析SmPAP1的過(guò)表達(dá)是否能夠激活其自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。GUS組織化學(xué)染色和GUS蛋白活性檢測(cè)結(jié)果表明,SmPAP1的過(guò)表達(dá)能夠提高煙草細(xì)胞中GUS基因表達(dá)量及GUS蛋白活性,并且與對(duì)照組相比,其活性提高了5.15～15.50倍。說(shuō)明SmPAP1轉(zhuǎn)錄因子具有在胞內(nèi)對(duì)自身啟動(dòng)子進(jìn)行激活的能力。2.利用葉盤轉(zhuǎn)化法將表達(dá)載體SmPAP1-Promoter::GUS分別轉(zhuǎn)化到SmPAP1過(guò)表達(dá)、SmPAP1沉默及野生型丹參植株中,分析在丹參中SmPAP1表達(dá)量不同的情況下其自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性變化。經(jīng)PCR檢測(cè),分別獲得9個(gè)過(guò)表達(dá)陽(yáng)性株系(OE),16個(gè)沉默陽(yáng)性株系(ir)和7個(gè)野生型陽(yáng)性株系(C.K.)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組(C.K.)相比,過(guò)表達(dá)陽(yáng)性株系中GUS基因表達(dá)水平均表現(xiàn)出不同程度的升高,而沉默陽(yáng)性株系中GUS基因表達(dá)水平則顯著降低。GUS染色及GUS蛋白活性檢測(cè)結(jié)果表明,GUS基因表達(dá)量及GUS蛋白活性均與丹參中SmPAP1基因的表達(dá)量呈明顯正相關(guān)：當(dāng)SmPAP1表達(dá)量升高時(shí),GUS染色加深且蛋白活性顯著升高,為對(duì)照組(C.K.)的1.43～2.13倍；相反當(dāng)SmPAP1表達(dá)量降低時(shí),GUS染色變淺且蛋白活性極顯著降低,為對(duì)照組的1.30%-2.99%。說(shuō)明在丹參中SmPAP1能夠直接或間接地激活其自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。3.為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1對(duì)丹參次生代謝途徑的潛在調(diào)控作用,對(duì)丹參野生型及SmPAP1過(guò)表達(dá)株系進(jìn)行基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的差異基因篩選。結(jié)果顯示,與野生型植株相比,共有1,559條基因表達(dá)量發(fā)生顯著變化,其中566條基因表達(dá)量上調(diào),993條基因表達(dá)量下調(diào)。Gene Ontology功能顯著性富集分析結(jié)果顯示,差異基因共參與了69個(gè)GO ter m,即25個(gè)生物過(guò)程、38個(gè)分子功能以及6個(gè)細(xì)胞組成,較為顯著的GO分類有催化活性、響應(yīng)外界脅迫等。KEGG Pathway分析結(jié)果顯示,差異基因共參與了75條代謝途徑,顯著富集的途徑為9條,包括苯丙烷生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、二萜類生物合成途徑等。其中,次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中富集的差異基因數(shù)目最多,顯著性也最強(qiáng)。說(shuō)明,在丹參中過(guò)表達(dá)SmPAP1后,主要影響丹參次生代謝途徑。對(duì)差異基因進(jìn)一步分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1可能通過(guò)激活酪氨酸代謝途徑中TAT和苯丙烷代謝途徑中PAL基因的表達(dá),促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的合成積累；同時(shí),SmPAP1基因的過(guò)量表達(dá)還降低了丹參酮類物質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵酶基因CPS的轉(zhuǎn)錄水平。本研究通過(guò)體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究了轉(zhuǎn)錄因子SmPAP1對(duì)其自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證明了在丹參中存在5SmPAP1基因的轉(zhuǎn)錄自激活調(diào)控。另外,SmPAP1基因參與了多條次生代謝途徑的調(diào)控,可能是通過(guò)調(diào)控PAL和TAT的表達(dá)影響丹酚酸類物質(zhì)合成。本研究為闡明SmPAP1轉(zhuǎn)錄因子的分子功能及調(diào)控機(jī)制提供一定的資料。
【學(xué)位授予單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2;S567.53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王健;李封塵;;丹參SmPAP1基因組DNA的克隆及其拷貝數(shù)的驗(yàn)定[J];分子植物育種;2015年11期

2 王健;王浩如;;SmPAP1基因特異性沉默導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因丹參體內(nèi)的酚酸含量顯著下降[J];分子植物育種;2015年10期

3 虞建新;吳奇;楊歡;;丹參酮ⅡA對(duì)高糖誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用[J];中國(guó)病理生理雜志;2015年09期

4 郭光艷;柏峰;劉偉;秘彩莉;;轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年07期

5 SU Chun-Yan;MING Qian-Liang;RAHMAN Khalid;HAN Ting;QIN Lu-Ping;;Salvia miltiorrhiza: Traditional medicinal uses, chemistry, and pharmacology[J];Chinese Journal of Natural Medicines;2015年03期

6 肖玲芳;張衛(wèi)芳;龔志成;;丹酚酸B的心血管藥理研究進(jìn)展[J];中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志;2015年01期

7 田愛梅;張恩慧;許忠民;丁群英;付洪冰;;白芨MYB類轉(zhuǎn)錄因子PAP1基因的克隆與表達(dá)分析[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2014年03期

8 劉紅亮;鄭麗明;劉青青;權(quán)富生;張涌;;非模式生物轉(zhuǎn)錄組研究[J];遺傳;2013年08期

9 左然;徐美玲;柴國(guó)華;周功克;;植物MYB轉(zhuǎn)錄因子功能及調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年10期

10 任貴華;李躍魁;康喜元;;復(fù)方丹參注射液抗炎鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2010年14期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張順倉(cāng);丹參酚酸類成分生源合成調(diào)控相關(guān)基因的克隆與功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 李封辰;丹參SmPAP1基因的表達(dá)調(diào)控模式分析[D];陜西師范大學(xué);2013年

2 易博;丹參迷迭香酸代謝酪氨酸支路重要基因克隆及調(diào)控分析[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 段艷冰;丹參中迷迭香酸生物合成途徑的苯丙氨酸支路基因的克隆及研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2211563