【摘要】：新疆狗牙根在有雪覆蓋的情況下能耐-32℃低溫,是一種優(yōu)良的抗寒狗牙根資源,為探討其抗寒分子機制,挖掘抗寒基因,本研究在關(guān)聯(lián)分析確定關(guān)聯(lián)位點的基礎(chǔ)上,利用BSA法獲取狗牙根抗寒相關(guān)差異序列,結(jié)合電子克隆和RT-PCR方法克隆狗牙根抗寒基因,并對其功能進行初步驗證。主要研究結(jié)果如下:利用已知抗寒相關(guān)位點對狗牙根抗寒和寒敏感基因池進行PCR擴增,獲得抗寒相關(guān)差異片段,并對其序列進行分析。共獲得差異片段43個,26條序列成功測序;經(jīng)生物信息學(xué)分析,17條差異序列具有同源序列,其中14條為代謝酶類及蛋白等,3條差異序列為未知位點;9條序列未找到同源序列,可能是一些新基因;其中差異序列ES8174-2與水稻小分子量低溫誘導(dǎo)膜蛋白LTI6A、玉米疏水性蛋白LTI6A和狼尾草低溫和鹽響應(yīng)蛋白同源性較高,一致性分別達到94%、90%和93%。以ES8174-2片段為基礎(chǔ),進行電子克隆。根據(jù)電子克隆的基因相關(guān)序列設(shè)計引物,并結(jié)合RT-PCR的方法從新農(nóng)1號狗牙根中克隆到狗牙根LTI6A基因。經(jīng)分析,該基因與電子克隆序列一致性達到93%;利用生物信息學(xué)的方法進行功能預(yù)測,表明狗牙根LTI6A基因編碼蛋白的分子量為6229.6 Da,理論等電點pI:4.56,原子組成為C306H462N60O70S4,消光系數(shù)14105,不穩(wěn)定系數(shù)為40.11,親水性平均系數(shù)為1.509,脂肪系數(shù)為141.07;含有兩個跨膜結(jié)構(gòu)、無信號肽、為疏水蛋白并且定位于細胞質(zhì)膜中。狗牙根LTI6A基因編碼的蛋白可能與水稻OsLTI6A基因編碼的蛋白在細胞內(nèi)部執(zhí)行的功能相似。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了表達載體pCAMBIA1301-LTI6A,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將狗牙根LTI6A基因插入到煙草基因組中。對獲得的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株進行低溫脅迫處理,與陰性對照相比,轉(zhuǎn)基因煙草植株相對電導(dǎo)率較低;恢復(fù)正常溫度培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因煙草植株未出現(xiàn)冷凍斑點。說明該基因能夠減少電解質(zhì)外滲提高膜的穩(wěn)定性,初步表明狗牙根LTI6A基因可以提高植物的抗寒性。
[Abstract]:Xinjiang dogtooth has the ability to withstand -32 鈩，

本文編號：2207945