【摘要】：小菜蛾(Plutella xylostella L.)屬于鱗翅目菜蛾科,其寄主高達四十多種,被認為是十字花科的蔬菜如甘藍、青菜等的主要害蟲之一。如今控制害蟲的一個重要手段就是化學防治。然而隨著殺蟲劑的不斷使用,小菜蛾對許多殺蟲劑都已經產生了抗藥性,并且已經成為病蟲害防治中的一大障礙。研究和發(fā)現(xiàn)新的與抗藥性相關基因將有助于了解抗藥性的分子基礎,有利于尋找新的治理抗性的靶標。本實驗室前期研究證明UBL40與小菜蛾的溴氰菊酯抗性有關,但UBL40是融合基因,UB基因編碼泛素蛋白,L40基因編碼核糖體蛋白。在抗藥性產生的過程中,是UB基因還是L40基因或是二者都發(fā)揮作用,需要進一步研究。本文在前期實驗的基礎上,對UB和L40與抗藥性的關系分別進行了研究,主要結果如下：1)在果蠅細胞中,用不同濃度的溴氰菊酯分別刺激細胞48h,然后熒光定量分別檢測細胞中UB和L40的表達量,結果表明,UB和L40的表達量均有不同程度的上升。隨后選取一個適宜的溴氰菊酯濃度,刺激果蠅細胞不同時間,結果發(fā)現(xiàn),UB和L40的表達量也均上升。這為下一步的實驗奠定了基礎。2)擴增UB和L40基因全長,然后在果蠅細胞中進行轉染,并在基因和蛋白質水平上檢測轉染效率,在檢測轉染成功的果蠅細胞中,用不同濃度的溴氰菊酯進行刺激,然后用CCK-8試劑盒檢測細胞的死亡率,結果表明,轉染了UB或轉染了L40的果蠅細胞與對照組相比對溴氰菊酯的抗性均有顯著的增加。3)用RNAi試劑盒合成UB和L40的dsRNA,然后在果蠅細胞中進行干擾,同樣在基因水平和蛋白質水平進行檢測干擾效率,在干擾成功的果蠅細胞中,用不同濃度的溴氰菊酯刺激48h,然后CCK-8檢測細胞死亡率。結果發(fā)現(xiàn),干擾了UB或干擾了L40的果蠅細胞與對照組相比對溴氰菊酯的抗性均有不同程度的降低。4)運用RNAi技術在溴氰菊酯抗性品系小菜蛾幼蟲中對UB和L40進行干擾,然后運用生測方法檢測小菜蛾的死亡率,結果顯示干擾了UB或干擾了L40的小菜蛾與對照組相比,對溴氰菊酯的抗性水平顯著降低,小菜蛾的成活率下降。由此我們得出結論,在融合基因UBL40中,UB和L40基因均參與了溴氰菊酯的抗性形成,這為溴氰菊酯抗性機理研究提供了新的線索,但其相關機制尚需進一步研究。
[Abstract]:Diamondback moth (Plutella xylostella L.) Lepidoptera belongs to the family Lepidoptera with more than 40 hosts and is considered to be one of the main pests of cruciferous vegetables such as cabbage and green vegetables. Chemical control is an important means of pest control nowadays. However, with the continuous use of pesticides, Plutella xylostella has developed resistance to many insecticides and has become a major obstacle in pest control. The research and discovery of new genes related to drug resistance will be helpful to understand the molecular basis of drug resistance and to find new targets for resistance management. Our previous study proved that UBL40 is related to the deltamethrin resistance of Plutella xylostella, but UBL40 is a fusion gene encoding UB gene encoding ubiquitin protein and L40 gene encoding ribosomal protein. Whether the UB gene or L 40 gene or both play a role in the development of drug resistance needs further study. On the basis of previous experiments, the relationship between UB and L40 and drug resistance were studied respectively. The main results are as follows: 1) in Drosophila cells, The cells were stimulated with different concentrations of deltamethrin for 48 hours, and then the expression of UB and L40 in the cells were detected quantitatively by fluorescence. The results showed that the expression of UB and L40 increased in different degrees. Then a suitable concentration of deltamethrin was selected to stimulate Drosophila cells for different time. The results showed that the expression of UB and L40 also increased. This laid a foundation for the next experiment. 2) amplifying the full length of UB and L40 genes, then transfecting them in Drosophila cells, detecting transfection efficiency at gene and protein levels, and detecting transfection efficiency in successfully transfected Drosophila cells. Different concentrations of deltamethrin were used to stimulate, and then CCK-8 kit was used to detect the cell death rate. The resistance of Drosophila cells transfected with UB or L40 to deltamethrin was significantly increased by 3. 3) UB and L40 dsRNA, were synthesized by RNAi kit and then interfered in Drosophila cells. The interference efficiency was also detected at the gene level and protein level. In Drosophila melanogaster cells with different concentrations of deltamethrin for 48 hours, the cell death rate was measured by CCK-8. The results showed that the resistance to deltamethrin of Drosophila melanogaster cells which interfered with UB or L40 decreased to varying degrees compared with the control group. The RNAi technique was used to interfere with UB and L40 in diamondback moth larvae, a Deltamethrin resistant strain. Then the death rate of Plutella xylostella was detected by bioassay. The results showed that the level of resistance to deltamethrin and survival rate of diamondback moth decreased significantly compared with the control group which interfered with UB or L40. It is concluded that both UB and L40 genes are involved in the formation of deltamethrin resistance in the fusion gene UBL40, which provides a new clue for the study of deltamethrin resistance mechanism, but the related mechanisms need to be further studied.
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4

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本文編號：2206013