發(fā)布時(shí)間：2018-08-26 20:05

【摘要】：小菜蛾(Plutella xylostella L.)屬于鱗翅目菜蛾科,其寄主高達(dá)四十多種,被認(rèn)為是十字花科的蔬菜如甘藍(lán)、青菜等的主要害蟲之一。如今控制害蟲的一個(gè)重要手段就是化學(xué)防治。然而隨著殺蟲劑的不斷使用,小菜蛾對許多殺蟲劑都已經(jīng)產(chǎn)生了抗藥性,并且已經(jīng)成為病蟲害防治中的一大障礙。研究和發(fā)現(xiàn)新的與抗藥性相關(guān)基因?qū)⒂兄诹私饪顾幮缘姆肿踊A(chǔ),有利于尋找新的治理抗性的靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證明UBL40與小菜蛾的溴氰菊酯抗性有關(guān),但UBL40是融合基因,UB基因編碼泛素蛋白,L40基因編碼核糖體蛋白。在抗藥性產(chǎn)生的過程中,是UB基因還是L40基因或是二者都發(fā)揮作用,需要進(jìn)一步研究。本文在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對UB和L40與抗藥性的關(guān)系分別進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下：1)在果蠅細(xì)胞中,用不同濃度的溴氰菊酯分別刺激細(xì)胞48h,然后熒光定量分別檢測細(xì)胞中UB和L40的表達(dá)量,結(jié)果表明,UB和L40的表達(dá)量均有不同程度的上升。隨后選取一個(gè)適宜的溴氰菊酯濃度,刺激果蠅細(xì)胞不同時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UB和L40的表達(dá)量也均上升。這為下一步的實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。2)擴(kuò)增UB和L40基因全長,然后在果蠅細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并在基因和蛋白質(zhì)水平上檢測轉(zhuǎn)染效率,在檢測轉(zhuǎn)染成功的果蠅細(xì)胞中,用不同濃度的溴氰菊酯進(jìn)行刺激,然后用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的死亡率,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染了UB或轉(zhuǎn)染了L40的果蠅細(xì)胞與對照組相比對溴氰菊酯的抗性均有顯著的增加。3)用RNAi試劑盒合成UB和L40的dsRNA,然后在果蠅細(xì)胞中進(jìn)行干擾,同樣在基因水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)行檢測干擾效率,在干擾成功的果蠅細(xì)胞中,用不同濃度的溴氰菊酯刺激48h,然后CCK-8檢測細(xì)胞死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),干擾了UB或干擾了L40的果蠅細(xì)胞與對照組相比對溴氰菊酯的抗性均有不同程度的降低。4)運(yùn)用RNAi技術(shù)在溴氰菊酯抗性品系小菜蛾幼蟲中對UB和L40進(jìn)行干擾,然后運(yùn)用生測方法檢測小菜蛾的死亡率,結(jié)果顯示干擾了UB或干擾了L40的小菜蛾與對照組相比,對溴氰菊酯的抗性水平顯著降低,小菜蛾的成活率下降。由此我們得出結(jié)論,在融合基因UBL40中,UB和L40基因均參與了溴氰菊酯的抗性形成,這為溴氰菊酯抗性機(jī)理研究提供了新的線索,但其相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Diamondback moth (Plutella xylostella L.) Lepidoptera belongs to the family Lepidoptera with more than 40 hosts and is considered to be one of the main pests of cruciferous vegetables such as cabbage and green vegetables. Chemical control is an important means of pest control nowadays. However, with the continuous use of pesticides, Plutella xylostella has developed resistance to many insecticides and has become a major obstacle in pest control. The research and discovery of new genes related to drug resistance will be helpful to understand the molecular basis of drug resistance and to find new targets for resistance management. Our previous study proved that UBL40 is related to the deltamethrin resistance of Plutella xylostella, but UBL40 is a fusion gene encoding UB gene encoding ubiquitin protein and L40 gene encoding ribosomal protein. Whether the UB gene or L 40 gene or both play a role in the development of drug resistance needs further study. On the basis of previous experiments, the relationship between UB and L40 and drug resistance were studied respectively. The main results are as follows: 1) in Drosophila cells, The cells were stimulated with different concentrations of deltamethrin for 48 hours, and then the expression of UB and L40 in the cells were detected quantitatively by fluorescence. The results showed that the expression of UB and L40 increased in different degrees. Then a suitable concentration of deltamethrin was selected to stimulate Drosophila cells for different time. The results showed that the expression of UB and L40 also increased. This laid a foundation for the next experiment. 2) amplifying the full length of UB and L40 genes, then transfecting them in Drosophila cells, detecting transfection efficiency at gene and protein levels, and detecting transfection efficiency in successfully transfected Drosophila cells. Different concentrations of deltamethrin were used to stimulate, and then CCK-8 kit was used to detect the cell death rate. The resistance of Drosophila cells transfected with UB or L40 to deltamethrin was significantly increased by 3. 3) UB and L40 dsRNA, were synthesized by RNAi kit and then interfered in Drosophila cells. The interference efficiency was also detected at the gene level and protein level. In Drosophila melanogaster cells with different concentrations of deltamethrin for 48 hours, the cell death rate was measured by CCK-8. The results showed that the resistance to deltamethrin of Drosophila melanogaster cells which interfered with UB or L40 decreased to varying degrees compared with the control group. The RNAi technique was used to interfere with UB and L40 in diamondback moth larvae, a Deltamethrin resistant strain. Then the death rate of Plutella xylostella was detected by bioassay. The results showed that the level of resistance to deltamethrin and survival rate of diamondback moth decreased significantly compared with the control group which interfered with UB or L40. It is concluded that both UB and L40 genes are involved in the formation of deltamethrin resistance in the fusion gene UBL40, which provides a new clue for the study of deltamethrin resistance mechanism, but the related mechanisms need to be further studied.
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S433.4

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本文編號：2206013