【摘要】：自上世紀(jì)90年代開始,包括我國在內(nèi)的全球多個國家和地區(qū)的多種養(yǎng)殖雙殼貝類在春夏季水溫較高時頻繁發(fā)生大規(guī)模死亡。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查和人工感染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,一種皰疹樣病毒的感染與這些死亡事件密切相關(guān)。國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Virus,ICTV)2012年發(fā)布的分類報告將該病毒命名為牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1,Os HV-1),該病毒是皰疹病毒目(Herpesviridae)、軟體動物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae)、牡蠣病毒屬(Ostreavirus)下唯一的病毒種。分子流行病學(xué)調(diào)查顯示,與最早發(fā)現(xiàn)的病毒株相比,該病毒還有其他病毒株的分化,隨著時間推移和空間的轉(zhuǎn)換,該病毒還有新的變異株不斷產(chǎn)生并被發(fā)現(xiàn),不同變異株間宿主范圍、毒力、發(fā)病時間、空間分布等流行病學(xué)特征也有所不同。我們的研究目標(biāo)是建立感染雙殼貝類的皰疹病毒主要變異株的檢測鑒定方法和基因分型系統(tǒng),掌握其感染情況,探索其主要變異株的分子流行病學(xué)特征,建立健康的養(yǎng)殖模式,做好對該類病害的防控工作。本研究還對引起我國養(yǎng)殖貝類發(fā)病的幾種寄生蟲—派琴蟲(Perkinsus spp.)、折光馬爾太蟲(Marteilia refringens)、包納米蟲(Bonamia spp.)進(jìn)行了抽樣檢測,以期掌握我國養(yǎng)殖貝類的寄生蟲感染現(xiàn)狀,作好針對性的預(yù)防和治療措施,保證貝類養(yǎng)殖業(yè)健康、穩(wěn)定地發(fā)展。研究方法、部分結(jié)果及結(jié)論如下:第一部分:對Os HV-1、AVNV、Os HV-1 SB三個主要變異株的一段保守序列—DNA聚合酶基因(DNA polymerase gene)進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)三者該區(qū)域的序列完全一致。針對這一段序列(約5600bp)利用primer5.0設(shè)計巢式PCR的內(nèi)外引物,外引物的擴(kuò)增片段長度為573bp,內(nèi)引物的擴(kuò)增片段長度為386bp,優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系和條件,建立了牡蠣皰疹病毒巢式PCR檢測法(P-n PCR檢測方法)。利用該巢式PCR檢測法與基于病毒基因組C區(qū)序列建立的巢式PCR檢測法(C-n PCR檢測方法)對同一批采集于不同年份和宿主來源的Os HV-1疑似感染樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示,P-n PCR檢測方法能穩(wěn)定地檢出100拷貝/μL的病毒DNA,與C-n PCR檢測法相比,具有更強(qiáng)的特異性和更高的檢出率。研究表明,本研究建立的P-n PCR檢測方法適用于Os HV-1不同變異株的檢測,可為該病毒的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的技術(shù)支持。第二部分:利用4對引物C2/C6、Del36-37F2/Del36-37R、IA1/IA2、NC1/NC2對2001年至2014年間采自我國遼寧、山東兩省的沿海養(yǎng)殖區(qū)的278個貝類病料樣本DNA提取物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR反應(yīng)后結(jié)果呈Os HV-1陽性的PCR產(chǎn)物送測序公司測序。利用Mega6.0軟件分別對每對引物所獲得的測序結(jié)果,及一些從genebank上下載的Os HV-1主要變異株序列進(jìn)行比對分析,建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,研究本實(shí)驗(yàn)中樣品間及與之前研究中的Os HV-1主要變異株間的序列變化情況及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)中所選的278個樣品中的Os HV-1變異株,在基因組的C2/C6區(qū)、NC1/NC2區(qū)發(fā)生了較大的變異,其中根據(jù)C2/C6區(qū)序列的變化118個樣本產(chǎn)生了11個變異株,根據(jù)NC1/NC2區(qū)序列的變化56個樣本產(chǎn)生了26個變異株。這些變異株除了在C2/C6區(qū)的微衛(wèi)星區(qū)產(chǎn)生較大的變異外,其余變化均為零星堿基的增添、缺失或改變。綜合4個區(qū)域的堿基變化情況,最終確定實(shí)驗(yàn)中所選的所有Os HV-1變異株與AVNV和Os HV-1 SB關(guān)系較近,與Os HV-1和Os HV-1μVar關(guān)系較遠(yuǎn),與之前研究中的病毒流行病學(xué)特征相符。本實(shí)驗(yàn)對全面研究感染我國雙殼貝類的Os HV-1的基因分型和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供了借鑒。第三部分:采用世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的檢測派琴蟲(Perkinsus spp.)、折光馬爾太蟲(Marteilia refringens)、包納米蟲(Bonamia spp.)的引物對實(shí)驗(yàn)室保存的2007-2013年間采集于我國遼寧、山東、廣東、廣西、福建等省份及韓國沿海地區(qū)的牡蠣、貽貝、蛤蜊、扇貝等進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果顯示,派琴蟲的感染主要發(fā)生在遼寧大連、山東青島、山東榮成、山東濰坊,其他地區(qū)未發(fā)現(xiàn)該原蟲的感染。從發(fā)生感染的時間上看,主要發(fā)生在7、8、9月水溫相對較高的季節(jié)。從宿主的種類上看,受感染的宿主主要為貽貝、菲律賓蛤仔和毛蚶。此次檢測中未發(fā)現(xiàn)折光馬爾太蟲和包納米蟲的感染。
[Abstract]:Since the 1990s, large-scale deaths of bivalve shellfish have occurred frequently in many countries and regions around the world, including China, in spring and summer when the water temperature is high. Epidemiological investigation and artificial infection experiments have proved that a herpes-like virus infection is closely related to these deaths. International Virus Classification Committee (I) The taxonomic report of the International Committee on Taxonomy of Virus (ICTV) published in 2012 named the virus Ostreid herpes virus 1 (Os HV-1), which is the only virus species under Herpes viridae, Malacoherpesviridae and Ostreavirus. The epidemiological investigation showed that there were other strains of the virus differentiated from the earliest one. With the passage of time and the transformation of space, new variants of the virus were produced and found continuously. The epidemiological characteristics of host range, virulence, onset time and spatial distribution among different variants were also different. The aim of this study is to establish a method for detection and identification of the main variants of herpesvirus infecting bivalve shellfish and a genotyping system, to master the infection situation, to explore the molecular epidemiological characteristics of the main variants, to establish a healthy breeding model, and to do a good job in the prevention and control of such diseases. Several kinds of parasites, Perkinsus spp., Marteilia refringens and Bonamia spp., were sampled and tested in order to know the status of parasite infection in shellfish farming in China, and to take preventive and therapeutic measures to ensure the healthy and stable development of shellfish farming industry. The results are as follows: Part 1: DNA polymerase gene, a conserved sequence of Os HV-1, AVNV and Os HV-1 SB, was compared and found to be identical in this region. For this sequence (about 5600 bp), primer 5.0 was used to design the internal and external primers of nested PCR and amplified fragments of external primers. The length of the amplified fragment was 573 bp, and the length of the amplified fragment was 386 bp. The PCR reaction system and conditions were optimized. A nested PCR assay for Oyster Herpesvirus (P-n PCR) was established. The results showed that the P-n PCR method could detect 100 copies/mu L of virus DNA stably. Compared with the C-n PCR method, it had stronger specificity and higher detection rate. To provide reliable technical support for the detection and epidemiological investigation of the virus. Part II: DNA extracts from 278 shellfish samples collected from Liaoning and Shandong coastal culture areas from 2001 to 2014 were amplified by PCR using four pairs of primers C2/C6, Del36-37F2/Del36-37R, IA1/IA2 and NC1/NC2, and the PCR results were presented as Os HV-1. The positive PCR products were sent to the sequencing company for sequencing. The sequencing results obtained by each pair of primers and the sequences of some major Os HV-1 mutants downloaded from genebank were analyzed by Mega 6.0 software respectively. A phylogenetic tree was established to study the sequence between samples and the major Os HV-1 mutants previously studied. The results showed that in the C2/C6 region of the genome, there were significant variations in the NC1/NC2 region of the Os HV-1 mutant strain from 278 samples selected in this study. Among them, 11 mutant strains were produced from 118 samples according to the variation of C2/C6 region sequence, and 26 mutant strains were produced from 56 samples according to the variation of NC1/NC2 region sequence. Except for the large variation in the microsatellite region of C2/C6 region, the other changes were sporadic base addition, deletion or alteration. Based on the analysis of the base changes in the four regions, it was determined that all the Os HV-1 mutants selected in the experiment had close relationship with AVNV and Os HV-1SB, and had far relationship with Os HV-1 and Os HV-1 mu Var. The results of this study are consistent with the epidemiological characteristics of the viruses. This study provides a reference for the comprehensive study of the genotyping and phylogenetic relationship of Os HV-1 in bivalve shellfish infected in China. Part III: The detection of Perkinsus spp., Marteilia refringens, and Bon nanoparticles recommended by the World Organization for Animal Health (OIE) The primers of AMIA spp. were collected from Liaoning, Shandong, Guangdong, Guangxi, Fujian provinces and coastal areas of South Korea from 2007 to 2013. The results showed that the infection of Parthenocissus spp. mainly occurred in Dalian, Shandong, Qingdao, Rongcheng, Weifang, Shandong and other areas. The infection occurred mainly in the relatively high water temperature seasons of July, August and September. The host species were mainly mussels, clams and clams. No refractive Maltesia and hydatid infection was found in this test.
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S944

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本文編號：2204159