【摘要】：雖然細(xì)菌外排泵的研究歷史較長,其涉及的藥物運(yùn)輸功能研究主要集中在病原菌中,根瘤菌中外排泵的研究較少,外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的功能表型和作用機(jī)制也值得深入研究。本文研究了華癸中慢生根瘤菌7653R中RND家族基因的功能。獲得了如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:一方面,我們基于前期工作中的根瘤菌7653R轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析發(fā)現(xiàn)MCHK_0866、MCHK_0867兩個(gè)基因在共生條件下明顯上調(diào)表達(dá),這兩個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物組成一個(gè)RND型外排泵。對(duì)外排泵編碼基因及候選調(diào)控基因在基因組上的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。采用測定OD600觀察菌株生長曲線的變化。通過測定最低抑菌濃度檢測菌株的藥物敏感性,RT-PCR檢測目的基因經(jīng)特定物質(zhì)處理后表達(dá)量的變化。通過細(xì)菌單雜交系統(tǒng)初步檢測外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示,MCHK_0866和MCHK_0867所編碼蛋白共同組成一個(gè)RND家族射流泵。缺失該外排泵后,細(xì)菌生長曲線在穩(wěn)定期OD600數(shù)值降低,對(duì)萘啶酸、四環(huán)素和SDS的敏感性發(fā)生變化,萘啶酸處理細(xì)菌后兩個(gè)基因的表達(dá)量增加。下游屬于TetR轉(zhuǎn)錄因子家族的基因MCHK_0869表達(dá)產(chǎn)物作用于MCHK_0867的啟動(dòng)子區(qū)域。該外排泵與萘啶酸的運(yùn)輸有關(guān),缺失后自生生長受到影響,表達(dá)受到下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。MCHK_0867插入失活后對(duì)結(jié)瘤能力和固氮酶活影響較大,與雙突變菌株共生表型相似。另一方面,本文選取另外3個(gè)在共生根瘤中表達(dá)水平無顯著變化的RND家族基因,分別構(gòu)建了其基因插入失活突變株。對(duì)突變菌株進(jìn)行了共生表型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCHK_0811和MCHK_3948基因失活后,對(duì)結(jié)瘤能力和根瘤固氮酶活有一定的影響;MCHK_6517失活后對(duì)共生表型沒有影響。上述結(jié)果為后續(xù)研究根瘤菌外排泵中與共生固氮相關(guān)基因的作用機(jī)制,提供了研究材料和工作基礎(chǔ)。
[Abstract]:Although the research of bacterial efflux pump has a long history, the research on drug transport function is mainly concentrated in pathogenic bacteria, and the research on Rhizobium efflux pump is less. The functional surface and mechanism of efflux pump system related genes in symbiotic nitrogen fixation of rhizobia are also worthy of further study. The function of RND family genes in Rhizobium sinensis 7653R was studied. The results are as follows: on the one hand, based on the data of 7653R transcriptome of Rhizobium, we found that the expression of MCHK0866MCHK0867 gene was upregulated obviously under symbiotic condition, and the two gene expression products constituted a RND type efflux pump. The tissue structure of external pump coding gene and candidate regulatory gene in genome were analyzed. OD600 was used to observe the change of growth curve. The drug sensitivity of the strain was detected by RT-PCR. The expression of target gene was detected by the treatment of specific substances. The transcriptional regulation of efflux pump was detected by single hybridization system. The results showed that MCHK0866 and MCHK_0867 encoded protein constitute a RND family jet pump. When the efflux pump was absent, the bacterial growth curve decreased at the stable stage of OD600, and the sensitivity to naphthalic acid, tetracycline and SDS changed, and the expression of the two genes increased after NAA treatment. The downstream MCHK_0869 expression products belonging to the TetR transcription factor family act on the promoter region of MCHK_0867. The efflux pump was related to the transport of naphthalic acid, and its expression was regulated by the downstream transcription factor. MCHK0867 had a great effect on nodule ability and nitrogenase activity after insertion and inactivation, which was similar to the symbiotic phenotype of the double mutant strain. On the other hand, three other RND family genes with no significant change in expression level in symbiotic nodule were selected, and their gene insertion inactivated mutants were constructed respectively. The symbiotic phenotype of mutant strain was tested. The results showed that the inactivation of MCHK_0811 and MCHK_3948 genes had no effect on nodule ability and nodule nitrogenase activity after inactivation of MCHK6517. These results provide a basis for further study on the mechanism of symbiotic nitrogen-fixing genes in rhizobia efflux pump.
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q933

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7 劉永芳;銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的耐藥性及其耐藥表型與外排泵表達(dá)的關(guān)系[D];四川大學(xué);2006年

8 宗自衛(wèi);銅綠假單胞菌中RND外排泵基因調(diào)節(jié)及功能研究[D];西北大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：2171144