發(fā)布時(shí)間：2018-08-06 17:33

【摘要】：瘋草類植物廣泛分布于我國(guó)西部草原,動(dòng)物采食該類植物后會(huì)出現(xiàn)頭部水平震顫、運(yùn)動(dòng)障礙等典型的瘋草中毒癥狀,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物死亡,給我國(guó)草原畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究表明,瘋草類植物的主要毒性成分是苦馬豆素(Swainsonine,SW),而瘋草棘豆蠕孢菌(Undifilum oxytropis)是瘋草內(nèi)苦馬豆素生物合成的根本原因。目前已知,苦馬豆素可由三類真菌產(chǎn)生,即豆類絲核菌(Rhizoctonia leguminicola)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)和瘋草棘豆蠕孢菌�？囫R豆素的生物合成通路在豆類絲核菌和金龜子綠僵菌中研究已較為深入,而有關(guān)瘋草棘豆蠕孢菌苦馬豆素的生物合成通路及調(diào)控合成的關(guān)鍵酶尚不清楚。課題組前期采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)瘋草棘豆蠕孢菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序,通過(guò)基因功能和注釋分析并篩選出了可能的參與苦馬豆素生物合成的部分關(guān)鍵酶,而吡咯啉-5-羧化還原酶(pyrroline-5-carboxylate reductase,P5CR)就是其中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控酶。鑒于此,本試驗(yàn)以瘋草棘豆蠕孢菌為研究對(duì)象,利用基因工程技術(shù)構(gòu)建瘋草棘豆蠕孢菌的P5CR基因敲除菌株,具體研究結(jié)果如下:1.根據(jù)瘋草棘豆蠕孢菌全基因組測(cè)序結(jié)果注釋的P5CR基因設(shè)計(jì)引物,以瘋草棘豆蠕孢菌cDNA為模板,高保真擴(kuò)增P5CR基因,PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與注釋的P5CR基因序列BLAST比對(duì)同源性為99%。2.以PUC19質(zhì)粒為載體,構(gòu)建了含潮霉素抗性基因的瘋草棘豆蠕孢菌P5CR基因的敲除載體,P5CR上游目的基因序列和下游目的基因序列分別連在潮霉素抗性基因的兩端。經(jīng)PCR驗(yàn)證、測(cè)序和雙酶切鑒定,成功構(gòu)建載體。3.將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒線性化后,利用REMI轉(zhuǎn)化法將線性化載體轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體,進(jìn)行瘋草棘豆蠕孢菌原生質(zhì)體P5CR基因的敲除。接著經(jīng)潮霉素篩選獲得轉(zhuǎn)化株,轉(zhuǎn)化株提取DNA,進(jìn)行PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示P5CR基因敲除菌株構(gòu)建成功。本研究成功獲得了瘋草棘豆蠕孢菌P5CR基因敲除菌株,為后續(xù)研究該基因?qū)Ο偛菁谷滏呔囫R豆素生物合成的影響及不產(chǎn)苦馬豆素瘋草新品種的培育奠定理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:The wild grass plants are widely distributed in the western grassland of our country. After feeding on this kind of plants, the animals will appear the typical symptoms such as head level tremor, dyskinesia and so on, which can lead to the death of animals. To our country prairie animal husbandry causes the huge economic loss. The results showed that the main toxic component of the plants was Swainsonine SW, and (Undifilum oxytropis) was the root cause of the biosynthesis. Up to now, it has been known that kudousuin can be produced by three kinds of fungi, I. e., (Rhizoctonia leguminicola), mycelia, Metarhizium anisopliae (Metarhizium anisopliae), and C. spp. The biosynthesis pathway of kussinin has been studied deeply in Rhizoctonia legume and Metarhizium anisopliae, but the biosynthesis pathway and the key enzyme of controlling the biosynthesis are not clear. The whole genome was sequenced by high-throughput sequencing technique in the early stage of the study. Some key enzymes involved in the biosynthesis of koumarin were screened through gene function and annotation analysis. Pyrrolidine-5-carboxylation reductase (pyrroline-5-carboxylate reductase P5CR) is one of the key regulatory enzymes. In view of this, the P5CR gene knockout strain was constructed by genetic engineering. The results are as follows: 1. A primer was designed based on the P5CR gene annotated from the whole genome sequencing results of Echinococcus spp. The results of high-fidelity amplification of P5CR gene and BLAST sequence of the annotated P5CR gene showed that the homology was 99. 2. 2. Using PUC19 plasmid as vector, the knockout vector P5CR upstream target gene and downstream target gene sequence of P5CR gene containing hygromycin resistance gene were constructed and linked to the two ends of hygromycin resistance gene, respectively. The vector was successfully constructed by PCR, sequencing and double enzyme digestion. After the plasmid was linearized, the linearized vector was transformed into protoplast by REMI transformation method, and the P5CR gene of the protoplast was knockout. Then the transformed strain was screened by hygromycin, the transformed strain was extracted from the transformed strain, and the PCR was verified. The results showed that the P5CR gene knockout strain was successfully constructed. In this study, the P5CR gene knockout strain was successfully obtained, which laid a theoretical foundation for the further study of the effect of the gene on the biosynthesis of C. spp.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q93;Q78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 黃玉茜,張恩然,潘維鋒;瘋草中毒的研究進(jìn)展[J];山東科學(xué);2003年04期

2 趙寶玉;董強(qiáng);史志誠(chéng);莫重輝;王凱;;瘋草靈解毒緩釋丸和瘋草毒素疫苗防治效果的比較[J];西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年06期

3 四朗玉珍;吳玉江;益西多吉;吳金措姆;趙寶玉;;西藏瘋草研究現(xiàn)狀[J];西藏科技;2013年03期

4 汪開(kāi)治;瘋草有毒可抗癌[J];植物雜志;1999年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前8條

1 王占新;路浩;趙寶玉;馬堯;陳基萍;劉忠艷;;美國(guó)動(dòng)物瘋草中毒診斷與防治技術(shù)研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

2 達(dá)能太;曹敏慧;劉圖雅;李國(guó)忠;東風(fēng);;家畜“瘋草"中毒病及綜合利用研究[A];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程與自然資源高效利用——中國(guó)科協(xié)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)（第10分會(huì)場(chǎng)）論文集[C];2005年

3 張j;周啟武;路浩;趙寶玉;龐龍;陳基萍;溫偉利;;中國(guó)西部草原動(dòng)物瘋草中毒病研究進(jìn)展[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)第七屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2011年

4 王建華;;中國(guó)瘋草的危害與防除[A];面向21世紀(jì)的科技進(jìn)步與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展（上冊(cè)）[C];1999年

5 趙寶玉;樊月圓;樊澤峰;董強(qiáng);曹光榮;;我國(guó)西部草原瘋草危害及其動(dòng)物中毒病的控制[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)第四屆全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文（摘要）集[C];2005年

6 達(dá)能太;趙寶玉;曹敏慧;烏蘭其其格;李國(guó)中;付登勝;張文軍;顧青年;達(dá)能太;路德勝;宋布爾巴圖;馬青城;阿拉騰烏拉;楊永剛;徐向軍;;內(nèi)蒙瘋草分布、危害與防治對(duì)策[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物毒物學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2009年

7 王保海;次仁多吉;王敬龍;趙寶玉;扎羅;秀花;;西藏草地瘋草研究進(jìn)展[A];2009中國(guó)草原發(fā)展論壇論文集[C];2009年

8 路浩;盧圍;趙寶玉;陳基萍;榮杰;龐龍;宋巖巖;;我國(guó)主要瘋草內(nèi)生真菌分離鑒定及其進(jìn)化分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜內(nèi)科學(xué)分會(huì)第七屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2011年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前8條

1 李陽(yáng);中國(guó)科學(xué)家研制出對(duì)付草原首害瘋草的“克星”[N];北京科技報(bào);2003年

2 王世煥李勇;草原瘋草有“克星”[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

3 楊凌;牲畜注射毒素疫苗草原瘋草變害為利[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2003年

4 張友;牛羊注疫苗 瘋草有“克星”[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2003年

5 記者王世煥、李勇;牲畜打疫苗 草原首害遇“克星”[N];人民日?qǐng)?bào);2003年

6 記者王世煥、李勇;科學(xué)家研制出有效疫苗有望成為草原瘋草克星[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2003年

7 黃興　許萬(wàn)虎;我國(guó)研制出扼制瘋草藥物[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2014年

8 記者　楊永林;西農(nóng)科大7年攻關(guān)制出毒草克星[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 崔振;瘋草與瘋草內(nèi)生真菌類群對(duì)應(yīng)關(guān)系研究[D];蘭州大學(xué);2015年

2 楊亞飛;基于“3S”技術(shù)的西藏瘋草管理系統(tǒng)研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

3 樊澤峰;“瘋草靈緩釋丸”預(yù)防綿羊棘豆中毒效果評(píng)價(jià)及田間藥效試驗(yàn)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

4 陳基萍;瘋草內(nèi)生真菌種屬鑒定及次生代謝產(chǎn)物研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

5 周啟武;瘋草內(nèi)生真菌多樣性及檢測(cè)方法研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

6 莫重輝;家畜瘋草中毒預(yù)防藥物研制和田間推廣試驗(yàn)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

7 康丹菊;瘋草內(nèi)生真菌菌絲體中苦馬豆素的分離與鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

8 郭偉;瘋草內(nèi)生菌FEL3培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其產(chǎn)SW的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

，

本文編號(hào)：2168471