【摘要】：【目的】馬鏈球菌獸疫亞種是工業(yè)上生產透明質酸的主要菌種,該菌能產生引起宿主細胞溶血的鏈球菌溶血素S(streptolysin S,SLS)毒素,因而其產品的安全性一直是人們所擔心的問題。本實驗的目的就是通過基因敲除的方法構建不產SLS的透明質酸生產工程菌,同時探討溶血素sag A基因缺失對菌株透明質酸合成和其他毒力因子的影響。【方法】利用溫度敏感/自殺性質粒p JR700載體系統(tǒng),構建馬鏈球菌獸疫亞種sag A基因缺失突變株;通過PCR擴增,溶血平板和SLS含量測定等方法確定sag A基因缺失;采用分光光度、SDS-PAGE和細胞毒性試驗等分析方法,對野生菌株和sag A基因缺失突變菌株透明質酸含量、透明質酸分子量、溶血素Hylc、透明質酸分解酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和菌體表面蛋白等相關毒力因子進行對比研究�！窘Y果】獲得了透明質酸產量提高30%而溶血活性極低的馬鏈球菌獸疫亞種sag A基因缺失突變株。該突變株與野生菌株相比較,透明質酸分解酶活性增加而透明質酸相對分子量降低,此外,與毒力相關的表面蛋白含量、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性也顯著降低。細胞毒性實驗結果表明,野生菌株與sag A基因缺失突變菌株的培養(yǎng)物上清液,對細胞活性的影響存在顯著差異。【結論】在馬鏈球菌獸疫亞種中sag A不僅是表達溶血素SLS的基因,同時sag A基因對菌株透明質酸合成、透明質酸分解酶、菌體表面蛋白、溶血素Hylc和甘油醛-3-磷酸脫氫酶等都具有調節(jié)作用。
[Abstract]:[objective] Streptococcus equi is the main strain producing hyaluronic acid in industry. It can produce streptococcal hemolysin (S (streptolysin) toxin which causes hemolysis of host cells. The aim of this study was to construct engineering bacteria that did not produce SLS with hyaluronic acid by gene knockout. At the same time, the effects of hemolysin sag A gene deletion on hyaluronic acid synthesis and other virulence factors were investigated. [methods] using the temperature sensitive / suicide plasmid p JR700 vector system, the mutant of sag A gene deletion of Streptococcus equi subspecies was constructed. The deletion of sag A gene was determined by PCR amplification, hemolysis plate and SLS assay, and the hyaluronic acid content of wild strain and mutant strain of sag A gene was determined by spectrophotometry SDS-PAGE and cytotoxicity test. Hyaluronic acid molecular weight, hemolysin Hylc, hyaluronidase, The virulence factors such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and bacterial surface protein were compared. [results] the mutant of sag A gene of Streptococcus equistii subspecies was obtained, which increased hyaluronic acid production by 30% and had very low hemolytic activity. Compared with wild strain, the activity of hyaluronidase increased and the relative molecular weight of hyaluronic acid decreased. In addition, the virulence related surface protein content, hemolysin Hylc and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase activity also decreased significantly. The results of cytotoxicity test showed that the culture supernatants of wild strain and sag A gene deletion mutant strain were supernatant. [conclusion] sag A is not only the gene that expresses hemolysin SLS, but also sag A gene on hyaluronic acid synthesis, hyaluronidase and cell surface protein in Streptococcus equi. Hemolysin Hylc and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase have regulatory effects.
【作者單位】： 西南交通大學生命科學與工程學院;
【基金】：國家自然科學基金(31070117) 四川省科技支撐項目(2012FZ0048)~~
【分類號】：TQ281;Q93

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