【摘要】：花生(Arachis hypogaea L)是我國乃至世界上重要的油料作物之一,因含有豐富的油脂和蛋白質而具有極高的營養(yǎng)價值以及經(jīng)濟價值。工業(yè)污染加劇以及農(nóng)業(yè)灌溉措施和化肥使用量的不當?shù)戎T多原因,造成次生鹽堿地面積日益擴大,已經(jīng)并將繼續(xù)威脅旱作花生的種植區(qū),嚴重影響了花生的產(chǎn)量和品質。因此,如何保證花生的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)和優(yōu)質成為育種的重大目標和技術難題。為了實現(xiàn)這一宏達的目標,加速花生品種的改良進程,研究者逐漸將研究方向轉移至耐鹽分子機理的研究,以期通過基因工程技術手段對現(xiàn)有品種進行遺傳改良,選育出耐鹽的花生新品種,為提高花生產(chǎn)量和品質提供實際應用的參考價值。鐵螯合酶催化亞鐵血紅素的合成,為呼吸鏈中的復合物以及過氧化物酶提供輔基。研究表明,亞鐵血紅素很可能作為一種溝通質體和細胞核的信號分子,參與干旱等逆境脅迫的響應。本課題意在克隆花生鐵螯合酶1基因并研究其在鹽脅迫下的功能。我們以擬南芥鐵螫合酶1基因(AtFC1, GI:145358447)為探針,比對搜索NCBI中花生EST數(shù)據(jù)庫獲得兩條同源的EST序列并予以拼接,根據(jù)拼接后的序列設計引物,以鹽脅迫處理的花生葉片為試材,利用RT-PCR和RACE技術克隆獲得花生鐵螯合酶1基因,對其進行了生物信息學分析和功能預測,通過在擬南芥原生質體中瞬時表達其與綠色熒光蛋白(GFP)的融合基因確定其在細胞中的位置,并通過在煙草中過表達該基因研究其在鹽脅迫響應中的功能。研究結果如下：(1)從鹽脅迫處理的花生葉片中克隆獲得完整的花生鐵螯合酶1基因的cDNA序列,命名為AhFC1,已在Genbank注冊為KU560625。該基因cDNA序列全長為1965 bp,5’端非翻譯區(qū)為157 bp,開放閱讀框長1449 bp,3’端非翻譯區(qū)為359 bp,編碼的蛋白質含482個氨基酸。(2)采用多種方法對其編碼蛋白進行結構域預測,發(fā)現(xiàn)AhFC1蛋白具有高度保守的鐵螫合酶N端和C端結構域,在這兩個結構域上分布有多個酶活性位點,在其C端還有一個跨膜區(qū),屬于不依賴于ATP的螯合酶II超家族成員,位于葉綠體區(qū)室中。在進化上,AhFC1蛋白和黃瓜的鐵螯合酶1親緣關系最近。(3)表達模式分析表明,干旱脅迫處理能夠迅速誘導AhFCl的表達量上升,6h后即可達到最大值,隨后開始緩慢降低。相對于干旱脅迫處理,鹽脅迫誘導的AhFCl呈緩慢上升趨勢,達到峰值所需的時間也相對延后,至12h才達到表達峰值,然后開始下降。(4)鹽脅迫下,轉AhFC1基因煙草的萌發(fā)率顯著高于野生型煙草。雖然轉基因煙草和野生型煙草葉片中的亞鐵血紅素均有所下降,但轉基因煙草的亞鐵血紅素含量顯著高于野生型。轉基因煙草葉片的ROS含量、MDA、電導率明顯低于野生型植株,而以亞鐵血紅素為輔基的CAT、APX等過氧化物酶活性較野生型煙草顯著升高。盡管轉基因煙草與野生型煙草葉片中的SOD活性均受到鹽脅迫誘導升高,但是二者并無明顯差異。以上結果表明,過量表達AhFCl基因提高了轉基因煙草的亞鐵血紅素含量和ROS清除能力,緩解了由鹽分引起的氧化脅迫,從而增強了轉基因煙草的耐鹽性。
[Abstract]:Arachis hypogaea L is one of the most important oil crops in our country and in the world. Because of its rich oil and protein, it has high nutritional value and economic value. The aggravation of industrial pollution and the improper use of agricultural irrigation measures and chemical fertilizer have caused the increase of the area of secondary saline and alkali land. The crop yield and quality of peanuts are seriously affected by the continued threat of peanut planting areas. Therefore, how to ensure stable yield, high yield and high quality of peanuts has become a major goal and technical problem for breeding. In order to achieve this goal and accelerate the improvement process of peanut varieties, researchers have gradually shifted the research direction to the molecular mechanism of salt tolerance. The study is aimed at genetic improvement of existing varieties by genetic engineering techniques and selecting new peanut varieties with salt tolerance to provide practical application for improving the yield and quality of peanut. Iron chelating enzyme catalyzes the synthesis of heme, which provides an auxiliary basis for the complex in the respiratory chain and the peroxidase. Hemoglobin is likely to be a signaling molecule to communicate plastids and nuclei and participate in drought stress response. This lesson is intended to clone peanut iron chelase 1 gene and study its function under salt stress. We use the Arabidopsis iron chelase 1 gene (AtFC1, GI: 145358447) as a probe to compare the peanut EST database in the search NCBI Two homologous EST sequences were obtained and the primers were designed according to the sequence after the splicing. The peanut leaves treated with salt stress were used as the test materials. The peanut iron chelating enzyme 1 gene was cloned by RT-PCR and RACE technology, and the bioinformatics analysis and function prediction were carried out. The gene was transiently expressed in the Arabidopsis protoplast. The fusion gene of fluorescent protein (GFP) determines its location in the cell and studies its function in salt stress response by overexpressing the gene in tobacco. The results are as follows: (1) a complete cDNA sequence of peanut iron chelating enzyme was cloned from the peanut leaves treated with salt stress, named AhFC1, which has been registered in Genbank KU560625. the full length of cDNA sequence is 1965 BP, the 5 'end non translation region is 157 BP, the open reading frame length is 1449 BP, the 3' end non translation region is 359 BP, the encoded protein contains 482 amino acids. (2) a variety of methods are used to predict the encoding protein of the protein. It is found that AhFC1 egg white has a highly conserved iron chelase N end and C terminal domain. There are several enzyme active sites on the two domains, and there is a transmembrane region at its C end, belonging to the II superfamily of the chelating enzyme, which is not dependent on ATP, and in the chloroplast compartment. In evolution, the relationship between the AhFC1 protein and the iron chelating enzyme of cucumber is closest. (3) the expression model analysis shows that the drought stress treatment can induce AhFC quickly. The expression of L increased, and then reached the maximum after 6h, and then began to decrease slowly. Compared with drought stress treatment, the AhFCl induced by salt stress was slowly rising, and the time needed to reach the peak was also relatively delayed, and the peak value reached to 12h, and then began to decline. (4) the germination rate of transgenic tobacco was significantly higher than that in the wild under salt stress. The heme of transgenic tobacco and wild type tobacco were decreased, but the content of heme of transgenic tobacco was significantly higher than that of wild type. The ROS content of transgenic tobacco leaves, MDA, electrical conductivity were significantly lower than that of wild type plants, while the activity of CAT, APX and other peroxidase activities in the heme supplemented group Although the SOD activity in transgenic tobacco and wild type tobacco leaves increased by salt stress, there was no significant difference between the two. The above results showed that overexpression of AhFCl gene increased the heme content and ROS scavenging ability of transgenic tobacco and alleviated the oxidative stress caused by salt. It is forced to enhance the salt tolerance of transgenic tobacco.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S565.2;Q943.2

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本文編號：2156940