【摘要】：干擾素是脊椎動物機(jī)體抵抗病毒感染的第一道防線,作為I-IFN的指示標(biāo)志,抗黏液病毒基因(myxovirus-resistant,Mx)具有較高的研究價(jià)值。目前關(guān)于鴨Mx的研究較少,本研究初步揭示了DHAV-1/-3感染鴨胚后,鴨胚部分組織器官中Mx與鴨IFN-α及相應(yīng)病毒載量之間的關(guān)系,為深入研究鴨的抗病毒免疫機(jī)制提供必要的理論基礎(chǔ)。本研究以感染DHAV-1的紹鴨腎組織的cDNA為模板,設(shè)計(jì)特異性引物,通過PCR擴(kuò)增獲得紹鴨Mx基因的CDs,并將其1435-2148bp亞克隆至pET-30a(+)原核表達(dá)載體中,在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),獲得重組鴨Mx蛋白(r Dup ET-30a-Mx),蛋白大小約為35k Da,利用Ni-NTA親和層析獲得純化的目的蛋白。以純化的rDupET-30a-Mx作為免疫原,免疫新西蘭大白兔,制備了兔抗鴨Mx蛋白多克隆抗體,經(jīng)I-ELISA檢測,抗體效價(jià)在1:102400以上。以重組蛋白為檢測抗原的Western blot結(jié)果顯示,制備的多抗能識別成年鴨和鴨胚中的Mx蛋白。分別以10~3ELD_(50)的DHAV-1和DHAV-3接于15日齡SPF鴨胚上,在接毒后3h、6h、12h、24h、48h取其心、肝、胃、腸、肌肉,q PCR檢測各組織中Mx、IFN-α及DHAV-1和DHAV-3的m RNA的相對表達(dá)量,Western blot檢測Mx蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,在心、肝、胃、腸、肌肉中,Mx與IFN-α的mRNA在3-12h變化趨勢基本一致;在心、肝、胃中,隨著Mx m RNA的上升,相應(yīng)的病毒載量有所下降。
[Abstract]:Interferon is the first line of defense against virus infection in vertebrates. As an indicator of I-IFN, anti-myxovirus-resistantMx gene is of great value. At present, there are few studies on duck MX. This study preliminarily revealed the relationship between MX and duck IFN- 偽 and the corresponding viral load in some tissues and organs of duck embryo after DHAV-1/-3 infection, which provides a necessary theoretical basis for further study of duck anti-virus immune mechanism. In this study, using the cDNA of Shao duck kidney tissue infected with DHAV-1 as a template, specific primers were designed to amplify the Mx gene of Shao duck by PCR amplification, and its 1435-2148bp was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-30a () and expressed in Escherichia coli expression system. The recombinant duck Mx protein (r Dup ET-30a-Mx) was obtained. The protein size was about 35 kDa. The purified protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The polyclonal antibody against duck Mx protein was prepared by immunizing New Zealand white rabbits with purified rDupET-30a-Mx. The antibody titer was over 1: 102400 by I-ELISA. The Western blot results using recombinant protein as antigen showed that the polyclonal antibody could recognize MX protein in adult duck and duck embryo. DHAV-1 and DHAV-3 of 10x3ELD50 were inoculated on 15-day-old SPF duck embryos respectively. The expression of MxtIFN- 偽 and DHAV-1 and DHAV-3 mRNA in tissues were detected by Western blot after inoculation for 48 h, liver, stomach, intestine, muscle, liver, stomach and intestine were collected at 3 h, 6 h, 12 h and 24 h after inoculation, and the expression level of MX protein was detected by Western blot. The results showed that the expression of MxtIFN- 偽 and DHAV-1 and DHAV-3 were detected by Western blot. The results showed that the mRNA of MX and IFN- 偽 in heart, liver, stomach, intestine and muscle were basically the same in 3-12 h, while in heart, liver and stomach, the corresponding viral load decreased with the increase of Mx m RNA.
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.32

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2152381